【毕业学位论文】（Word原稿）日本血吸虫童虫差异表达蛋白质组研究和童虫差异表达基因SjEnol的克隆和表达预防兽医学硕士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 日本血吸虫童虫差异表达蛋白质组研究和童虫差异表达基因 克隆和表达 on on 中文摘要 论文 题目 ： 日本血吸虫童虫差异表达蛋白质组研究和童虫差异表达基因 研究生姓名 ： 赵晓宇 指导 教师 ： 林矫矫 专 业 ： 预防兽医学 研究 方向： 寄生虫分子生物学 日本血吸虫病 (一种严重危害人类身体健康、影响经济和社会发展的人畜共患寄生虫病。不同发育阶段的血吸虫虫体在蛋白表达、生理生化特征等方面都存在一些差异。血吸虫童虫是血吸虫在终宿主体内发育的早期阶段，一些童虫差异表达蛋白可能对血吸虫生长发育至关重要。本研 究应用蛋白质组学技术分析、研究血吸虫童虫差异表达蛋白 ,克隆和表达了血吸虫童虫差异表达蛋白烯醇酶 因，为研制抗感染的分子疫苗、诊断抗原、新治疗药物提供基础。 本研究应 用 双向电泳技术 对日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫 (16 日龄 )和成虫（雌 、 雄虫 ，40 日龄 ） 虫体可溶性蛋白 进行了 分离，应用 件分析童虫、雌虫和雄虫的双向 电泳图谱 ，显示两个不同发育时期虫体在可溶性蛋白组分上分别分离到 2000 69、 110075 和 1310 18 个蛋白斑点， 这些蛋白斑点大部分在 0 80 8 的电泳图谱 区域 ,其中 童虫 蛋白电泳图谱中 呈现 26 2 个不同于成虫的特异表达 蛋白斑点 。 从童虫期差异表达的蛋白斑点中选取 10 个对比性最强的蛋白斑点进行质谱鉴定，结果成功地获得了其中 5 个蛋白斑点的肽指纹图谱检测数据，进一步通过 果表明 这些差异表达蛋白主要参与蛋白信号转导、能量代谢、转录、翻译调控和作为细胞构架蛋白等。 基于日本血吸虫期别差异表达蛋白质组的研究分析结果，选择一个童虫差异表达的蛋白分子进行深入研究，通过质 谱 (析鉴定得到该蛋白质的部分氨基酸序列，利用 其 核苷酸序列有 1305测编码 434 个氨基酸，同源分析表明该蛋白为日本血吸虫烯醇酶（ 构建了原核表达质粒 a（ +） 大肠杆菌中成功地获得了表达，重组蛋白分子量约 48P I 值为 验证明重组抗原有较好的抗原性。此外，应用生物信息学方法深入地分析了 白的二级结构，空间构象及功能结构域等生物学信息，可为进一步研究 提供参考资料。 关键词 : 日本血吸虫 蛋白质组学 童虫期差异表达蛋白 on is an in as as is of in of be in In of by of . to 6 as as 40 by 000 69, 1100 75 310 18 in as as of 0 80 I 8. 26 2 in to be by by of to A of RF 305 bp be 34 a（ +） of 8KD I to of of or 目 录 第一部分 引言 1 第一章 血吸虫病 1 血吸虫生物学 1 吸虫地位与种类 1 吸虫的生活史 1 吸虫的基因组 1 血吸虫病的流行、治疗及疫苗的研究进展 2 吸虫病的分布及形势 2 吸虫致病和治疗药物 2 血吸虫病疫苗的研究进展 3 第二章 血吸虫期别差异表达蛋白的研究 5 蛋白质组学 5 白质组学的提出 5 白质组学的意义 6 白质组学技术 6 血吸虫蛋白质组的研究 8 吸虫性别差异表达蛋白的研究 8 吸虫期别差异表达蛋白的研究 8 第二部分 研究内容 11第一章 日本血 吸虫童虫差异表达蛋白质组的研究 11 1. 实验材料 11 2. 方法 12 3. 结果与 讨论 19 第二章 日本血吸虫童虫期差异表达蛋白烯醇酶编码基因的克隆、表达及功能分析 27 1. 实验材料 28 2. 实验方法 31 3. 结果与 讨论 40 结论 59 参考文献 60 致谢 68 附录 69 作者简历 80 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 1 - 页 引 言 第一章 血吸虫病的基本概况 血吸虫生物学 血吸虫（ 称裂体吸虫，隶属于扁形动物门 (吸虫纲 (复殖目 (裂体科 (裂体亚科 (裂体属 (血吸虫成虫呈线形，雌雄异体，一般状况下雌、雄虫合抱寄生 于终宿主人体或牛、羊、猪、鼠、兔等哺乳动物的肝门静脉和肠系膜静脉中。寄生于人体的血吸虫常见的有三种：日本血吸虫（ S. 曼氏血吸虫（ S 埃及血吸虫（ S 毛守白等， 1990; 周述龙等， 2001）。 日本血吸虫的生活史比较复杂，经过虫卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫、成虫等 7 个发育阶段。转换两个宿主，终宿主为 40 多种哺乳类，中间宿主为钉螺。成熟雌虫在寄生的静脉中产卵，虫卵分布于终宿主的肠及肝中。虫卵经由宿主的粪便 排出，在有水环境中孵出毛蚴，毛蚴可自由游动并主动钻入宿主螺类，经母孢蚴、子孢蚴两个发育阶段。进行大量的无性繁殖最终形成尾蚴，尾蚴从螺体逸出感染终宿主，由童虫阶段发育为成虫。 血吸虫基因组具有典型真核生物特征，其复杂程度与软体动物相似，大小约为原虫基因组的 10倍，但仅为人类基因组的二十分之一（ 1982）。雌虫是异配（ 雄虫为同配（ 高磐等， 2000）。 2003）针对日本血吸虫的不同发育阶段虫体，进行了大规模的基因表达片段检测并作了全 面分析与验证，获得了 43707条表达序列标签（ 代表了约 13000个基因种类，约占日本血吸虫基因总数的 65 87，并克隆了全中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 2 - 页 长基因 611条。发现血吸虫的一些基因与脊椎动物特有的基因同源，提示血吸虫与哺乳动物宿主可能协同进化。 疗及疫苗的研究进展 血吸虫病是一种分布广、危害严重的人畜共患寄生虫病，是仅次于疟疾的第二重要热带病。据 计，血吸虫病主要流行于亚洲、非洲及拉丁美洲的 76 个国家和地区，全球估计有 5 6 亿人口遭受威胁，患病人 数达 2 亿（ 2001）。在我国流行的为日本血吸虫病，分布于长江流域及其以南的 7 个省、市、自治区， 108 个县，患者多达 82 万人，病畜数十万头， 9000 余万人口和数千万头家畜的健康受到威胁，每年为防治此病支出巨大（郑江等， 2003）。 一般认为，在人类几种主要血吸虫病中，日本血吸虫感染引起的病情最重、防治难度最大。这是因为日本血吸虫的动物宿主多，成虫寿命长，雌虫产卵量大，感染后的伴随免疫和治愈后的免疫力差，中间宿主钉螺不易控制等。 50 多年来，中国政府组织了大规模的防治和研究工作，取得举世瞩目的成就 。但目前我国血吸虫病的疫情仍十分严峻，特别是 近年来由于生 态 、自然和社会、经济等因素变化较大 ， 血吸虫病疫情回升显著 ，主要 表现为血吸虫病患病人数增多 ， 急性感染人数呈上升趋势 ， 局部地区钉螺扩散明显 ， 部分已经达到传播控制标准和传播阻断标准的地区疫情严重回升 ，伴随 出现向城市蔓延的趋势 ， 对人民健康、经济发展和社会进步构成 严重 威胁 ， 血 吸虫病的 防 治 工作形势严峻 ，急需开发研制新的高效的疫苗或治疗药物。 血吸虫生活史中的四个发育阶段：尾蚴、童虫、成虫和虫卵均可对宿主产生不同程度的损害和复杂的 免疫病理反应。由于各期致病因子的不同，宿主受损的组织、器官和机体反应性有所不同，引起的病变和临床表现亦具有相应的特点和阶段性。前三者所造成的病变，或为一过性的，或较轻微的，均不足以对人体造成严重损害，唯有虫卵沉积于组织内所诱发的虫卵肉芽肿反应乃是血吸虫病最重要的病理反应。血吸虫的虫卵在肝、肠等组织血管内形成，堵塞血管，破坏血管结构，会导致宿主肝、肠等组织纤维化，是血吸虫主要的致病源。 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 3 - 页 吡喹酮是目前血吸虫病主要的化学治疗药物，尽管治疗效果比较理想，但是由于重复感染情况严重，同时临床已经发现某些血吸虫虫株对吡喹 酮类药物产生抗药性（ ， 2003； ， 2001）。实践已表明单靠现有的化学治疗药物不能在中国最终控制和消灭血吸虫病。在中间宿主钉螺难以消灭，治疗药物不能解决血吸虫病重复感染的情况下，近年来国内外血防学术界已取得共识：发展抗血吸虫病疫苗以降低虫负荷 (抗感染疫苗 )，从而减少流行区的污染，或能减轻宿主组织 (主要为肝脏 )的免疫病理反应，以减轻病理损害 (抗病疫苗 )，无疑是一种控制血吸虫病的有效途径。 寄生虫学者根据血吸虫感染的某些 生物学特点，提出了发展抗血吸虫疫苗的可行性 , 人首先从动物实验结果肯定了血吸虫病可产生获得性免疫。目前已用于研究抗血吸虫病疫苗的材料包括：虫体粗抗原、保护性单克隆抗体、特性明确的抗原或酶、抗独特型抗体、基因重组抗原疫苗和 苗等。研究显示在所有被研究的疫苗中辐照致弱苗诱导的保护力最高（减虫率 50 ,其次为血吸虫虫体纯化抗原苗、抗独特型抗体和人工合成多肽苗（减虫率 20 。然而，上述几种疫苗要么无法大量生产，如辐照致弱童虫苗、虫体纯化抗原苗和人工合成多肽苗，要么诱导的保 护效果太低，因而都难以应用于现场。 进入八十年代初期 ， 国外开始 开展 血吸虫基因工程疫苗 的研究工作。 等 、 分别率先报道了 本血吸虫菲律宾株 26胱甘肽 和 氏血吸虫 28胱甘肽 编码基因的克隆、表达和初步的动物保护试验结果。国内本领域研究起步较晚 ， 九十年代才起动 ，近些 年主要是追踪世界卫生组织推荐的六种侯选疫苗抗原等研究成果 ， 针对在我国流行的日本血吸虫（中国大陆株） ， 克隆、鉴定、表达相关的抗原基因 ， 并评估这些基因及基因产物的生物学功能 。近年来， 我国 在 该领域的 研究发展迅速 ， 先后构建了不同生活史阶段的虫体 库 ， 克隆了 20 多个日本血吸虫中国大陆株抗原基因 ，研制了 10 多种血吸虫基因重组抗原候选疫苗或 苗 ，并且 先后应用于实验动物免疫保护试验 ， 还以牛、羊等大家畜为试验模型 ， 评价 了 几种重要候选疫苗的免疫保护效果 ， 获得了 40%左右的减虫率或减卵率 。 同时 ， 为进一步提高免疫保护效果 ， 积极开展 了 日本血吸虫新的重要功能基因 和基因组 的研究 工作 。 荐的最有希望的优先研究的抗血吸虫病的分子疫苗诱导出的免疫保护力一般为 30 减虫率，保护效果仍不够理想，还需进一步提高，还需要更深层次的研究，如应用蛋白质组中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 4 - 页 学、功能基因组学、生物信息学等方法，分析、分离血吸虫期别、性别差异表达蛋白 /基因等，为寻找出更多、更有价值的功能基因，为研制新的、高效的抗血吸虫病的基因工程疫苗和新药提供基础。 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 5 - 页 第二章 血吸虫期别差异 表达蛋白的研究 针对血吸虫特有的生物学特性，应用蛋白质组学的双向电泳技术、质谱分析技术、蛋白质信息学等技术方法分析血吸虫不同性别和不同发育阶段（期别）蛋白表达的动态变化，鉴定血吸虫各生长发育阶段或不同性别共有的蛋白组分和差异表达的蛋白组分。进一步将差异表达蛋白的编码基因分离、测序，进行分析、鉴定和功能研究，寻找出在血吸虫生长发育中起关键作用的酶、功能基因或功能蛋白分子，可为研制新的、高效的抗血吸虫病疫苗和新药提供新思路、新线索。 随着人类基因组工作序列草 图的完成和几十种生物全基因组测序的结束，人们工作重心将从揭示生命的遗传信息转到对功能的研究方向发展（ ， 2001）。蛋白质是生物体中一类重要的生物大分子物质，是生物体实现其功能的物质基础，生命活动的执行体，并且蛋白质亦有其自身特有的活动规律，随生命活动的进程表现出动态的紧密协调的变化。 因此，基因表达水平并不能精确地代表细胞中活性蛋白质的数量，基因组序列也并不能准确地描述活性蛋白质翻译后的修饰和反映蛋白质的种类和含量的动态变化过程。首先，对一个机体而言，基因的数目是恒定的，而蛋白质的种类和数目 在同一个机体的不同细胞中各不相同，即使同一细胞在不同的时期和不同条件下，其表达蛋白质也不相同。其次， 包括 种类和含量 )并不能完全反映出蛋白质的表达。因为蛋白质在翻译后的化学修饰（磷酸化、糖基化、酰基化等等）会对其活性产生重大影响，所以 身不足以提供所有相关信息。研究表明蛋白质与 相关系数仅为 计学表明一个基因在大肠杆菌中可表达 蛋白，在酵母中表达 3 种，而在人中为 10 种（ ，1999）。再者，蛋白质组中含量低的蛋白质在大规模的分析 鉴定中很难被检测到，而一些低表达量的蛋白质组分对细胞生物功能会产生重大影响。因而，对蛋白质的直接研究才能更真实地了解和解释各种生命现象及生命的活动机理。无论是从基因组研究的局限性，还是从蛋白质组学自身发展而言，大规模、全方位的蛋白质组学研究势在必行。 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 6 - 页 蛋白质组（ 概念是由澳大利亚 学的 1994 年意大利 向电泳会议上提出的（ ， 1995）。蛋白质组指的是基因组所表达的全套蛋白质，实 质是从蛋白质的水平研究、认识生命活动的机理和疾病发生的分子机制（ ， 1999）。 蛋白质组学意在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及其功能模式，其内容包括：蛋白质的表达和存在的方式 (修饰形式 )、结构、功能和蛋白质分子间相互作用等，是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行功能研究。 传统的蛋白质研究注重单一的蛋白质，而蛋白质组学重在研究参与特定生理或病理反应的所有蛋白质种类及其和周围环境的关系。从整体的角度来看，蛋白质组研究大致可以分为两个方向：一种是以细胞或组织的全部蛋白质为对象，着眼于整个蛋白 质组；另一种则是以与一个特定的生物学问题或机制相关的全部蛋白质为出发点。但两者的基本点都放在蛋白质组的变化或差异上，也就是通过对同一物质不同状态的样本中表达的蛋白质组分的比较分析，发现并鉴定在不同生理条件下或不同外界条件下蛋白质组中有差异表达的蛋白质分子。这就要求对蛋白质组进行表征 ,将所有蛋白质分离、鉴定及图谱化。蛋白质组学相关的研究工具通常都是高度自动化的系统，配合相应的分析软件和数据库，在最短的时间内处理最多的数据，找出有价值的生物学信息。 目前，开展蛋白质组学研究的技术已 较成熟，主要包括以下三个重要方面： 2 蛋白质分离的核心技术 利用蛋白质分子量不同和电荷差异的性质建立的双向电泳技术成为目前蛋白质组分离的基本方法。双向电泳是 1975年分别独立建立的（ O1975; ， 1975）。第一向为等电聚焦电泳，根据蛋白质等电点不同将之分离。目前，主要用于实验中的有 非平衡 度电泳 (H 种方法（郭尧君等， 2004）。第二向是聚丙烯酰胺凝胶电泳 (根据蛋白质分子量的差异将之分离。经过两次电泳，分子量和等电点不同的蛋白质分子便呈现在电泳图谱的不同位置上。通过配套的分析软件操作，可以得到蛋白质组相应的差异表达的生物学信息。 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 7 - 页 高分辨率、高重复性的电泳图谱离不开高质量的样品处理技术。剔除干扰物质、尽可能提高样品蛋白质组的溶解度 ，使某些特殊种类的蛋白质分子及痕量的蛋白质组也能在电泳图谱中充分展现。 样品中的核酸、脂、多糖、盐等会影响蛋白质的可溶性和 2重复性。可采用超离心、超声、透析、加入核酶等方法来清除干扰物质，利用化学变性剂 (离液剂、活性剂、还原剂 )解聚和溶解蛋白。近年来，随着研究发展了一些新的样品处理试剂，加上混合不同试剂的“鸡尾酒”溶解法提升了蛋白质的溶解度；应用蛋白质预分离技术和蛋白质的分步抽提技术提高了蛋白质双相电泳图谱的分辨率和满足对特殊种类的蛋白质进行分离研究的需要。 显现蛋白质斑点的电泳图谱是对双向电泳结果的衡量和评价。显现蛋白质斑点的技术包括 :考马斯亮兰 考马斯亮兰 酰胺黑（ 、丽春红 S(银染、负染、荧光染色等方法。银染和考马斯亮兰染色是使用最为广泛的两种染色方法，其中考马斯亮兰染色达到 100分辨率，而银染可达 1分辨率（ ， 1999）。伴随着染色技术的发展，将会有更多的微量蛋白出现在我们研究的视野里，有助于获得更多的蛋白信息。 一个具有重要意义的蛋白质分析鉴定技术 在形成蛋白质组学领域的过程中，质谱已经成为一个强有力的推动技术。目前，大多将酶解法、液相色谱分离技术、串联质谱技术及信息处理技术等技术方法相结合进行蛋白质的分析鉴定。 经过双向电泳分离的蛋白质斑点被切割下来，进行胶内酶解或转移到 上进行酶解，酶解产物可采用 S 测定肽序列 ,也可用 得肽质量指纹谱，利用 软件，查询相应的数据库，对目的蛋白质进行分析（ ， 2000）。 质谱技术除了鉴定蛋白质以外还可用于蛋白质定量、蛋白质二硫键的定量和定位、蛋白质间相互作用分析和蛋白质二级结构分析等。此外，氨基酸组成成份分析技术也可用于蛋白质的分析鉴定。但是，如果想获得非常可靠的结果，往往需要配合其它鉴定手段。 蛋白质信息学可以分析蛋白序列 (比如测定活性中心 )，进行蛋白多样性研究 (所使用的典型测量方法是双向凝胶和质谱分析 )，通过计算和实验的方法来预测蛋白质的结构与功能，在分析蛋白质相 互作用和作用的分子机制，以及在基因修正的系统研究中也起了关键作用。 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 8 - 页 随着后基因组学 蛋白质组学研究的兴起，针对血吸虫重要的生物学特征，应用蛋白质组学的双向电泳分离技术、质谱分析技术和蛋白质信息学等技术方法，分析血吸虫不同性别和不同发育阶段（期别）蛋白表达的动态变化，深入研究血吸虫差异表达的蛋白，为研制抗血吸虫病疫苗和治疗药物提供了新的方法。 吸虫性别差异表达蛋白的研究 （ 1982）分别用单向和双向电泳对曼氏血吸虫雌、雄虫蛋白质 组 进行分析 ，证实血吸虫雌、雄虫存在着差异表达的蛋白质分子。实验证明在 43，雄虫有一条比雌虫宽、长的由着色斑点组成的条带。这条带中雄虫有 7 个点，雌虫有 5 个点，属于血吸虫肌动蛋白不同的等电点类型，表明了血吸虫肌动蛋白表达存在明显差异性。同时还对双相电泳和 果进行了比较，显示了双相电泳在该研究中的优势和潜力。（ 1989）用双相电泳对曼氏血吸虫雌、雄虫表皮蛋白的性别差异进行了研究，发现肌动蛋白存在着差异表达。 （ 1973）用双相电泳技术对曼氏血吸虫雌雄特异 性蛋白进行了比较分析，发现有 5 种蛋白质为雄虫特有， 4 种为雌虫特有并且分子量均在 12下， 间。 国内关于血吸虫性别差异表达蛋白质组学的研究尚处于起步阶段。本研究组的朱建国等采用双向电泳技术对提取的日本血吸虫中国大陆株虫体蛋白进行了研究，实验证明血吸虫成虫蛋白质表达存在性别差异性。并应用基因克隆技术分离、鉴定了雄虫差异表达的抱雌沟蛋白编码基因 建了原核和真核重组质粒，应用基因重组抗原， 苗免疫小鼠，获得了一定的减虫率或减卵率（ 2001）。程国锋等（ 2004）利用双向电 泳技术对日本血吸虫雌、雄虫的表达蛋白进行了分析研究，结果表明在雌、雄虫可溶性蛋白中分别分离到 23 2和 41 4 个差异表达的蛋白斑点；疏水性差异表达的蛋白斑点有 26 3 和 11 1 个。利用质谱技术鉴定分析 12个雌虫和 18个雄虫差异表达蛋白，结果表明这些蛋白主要参与信号传导、代谢和转录调空等。 血吸虫期别差异表达蛋白的研究 中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 9 - 页 血吸虫的生活史相当复杂，经历虫卵、毛蚴、母孢蚴、子孢蚴、尾蚴、童虫、成虫等阶段。研究证明：雌虫、雄虫、童虫、虫卵各期虫体间存在共同组分的蛋白分子（吴涤等， 1997），同时，在不同 的发育时期表现出明显的蛋白表达期别差异性，期别差异性表达蛋白主要表现在 录的差异性和蛋白质表达的阶段性上。 国外学者开展了一些针对曼氏血吸虫期别差异表达蛋白的分析和鉴定（ ， 1982；， 1991； ， 1991）。 （ 2002）用大肠杆菌表达曼氏血吸虫重组弹性蛋白及由该蛋白免疫产生的抗血清，研究表明弹性蛋白酶表达具有期别特异性。（ 1995）克隆了曼氏血吸虫 14因，并用 迹分析其在各个阶段的表达，结果 表明在毛蚴、童虫和成虫中均表达，而在尾蚴阶段不表达，证明该基因在血吸虫不同发育时期蛋白表达有差异。 用曼氏血吸虫半胱氨酸蛋白酶 (单克隆抗体检测不同发育阶段的虫体匀浆物，结果在 8 天的童虫和成虫中能检测到 (白，而在尾蚴、虫卵及刚变形的童虫中检测不到（ ， 1992）。 日本血吸虫期别差异表达蛋白的研究起步较晚。吴涤等 1997用聚丙烯酰胺凝胶电泳(析、比较了日本血吸虫不同发育时期虫体的蛋白组成，在尾蚴、雌虫、雄虫和虫卵中各分离到 26、 51、 56 和 60 条蛋白带，其主带也不相同，表明日本血吸虫蛋白组表达存在期别差异性。 （ 1989）用尾蚴免疫兔血清筛选尾蚴 库，获得 隆 个编码 69 个氨基酸的蛋白质，分子量为 8经分析为钙结合蛋白（ 因。对该蛋白不同期别的表达研究发现：此蛋白只在尾蚴阶段表达，在这之前之后的各个阶段均不表达。 （ 1992）发现了主要在虫卵中表达的 16 蛋白质组学技术应用于日本血吸虫期别差异表 达蛋白的研究还不多见，其中本研究组的程国锋等利用蛋白质组学样品提取、双相电泳技术对日本血吸虫虫卵、童虫（ 14 日龄）和雌、雄虫膜蛋白进行了系统分析，结果表明雌虫呈现 35 1 个差异斑点，雄虫呈现 45 2个，虫卵有 2 个，童虫有 3 个。 血吸虫童虫是血吸虫在终宿主体内发育的早期阶段，虫体小，较成虫脆弱，对宿主的免疫效应机制特别敏感，容易受到免疫攻击；尤其是肺期、肝期童虫是其个体发育、性别分化的关键性阶段，更是宿主免疫系统攻击的靶标。一些血吸虫的童虫具有的差异表达蛋白可能与童虫的生长、发育、性别分化等息息相关 ,加强这些 差异表达蛋白的研究，选择性的分离、鉴定童虫的差异表达蛋白、克隆其编码基因、并进行蛋白表达和相关的动物免疫保护实验，可为研究高效的抗感染的分子疫苗提供基础资料。刘庆中等 2003成功地扩增、克隆和表达了中国农业科学院硕士学位论文 引言部分 第 - 10 - 页 日本血吸虫（中国大陆株） 14号蛋白的编码基因，研究表明在童虫中有高表达量。用 组的多肽疫苗和核酸疫苗免疫 c 小鼠获得了一定的免疫保护效果。卞茂红等（ 2002）利用免疫学方法筛选日本血吸虫肝期童虫 库，初步确定其中的一些阳性克隆有作为血吸虫病诊断抗原和免疫分子的可能性。 日本血吸虫各期虫体在形态和生理活动上呈现的明显不同，可能是由于在不同发育时期差异蛋白的表达量不同。目前 ,血吸虫期别差异表达蛋白的研究虽有报道，可还很不全面，对蛋白质组的研究相对则更加滞后。因此，应用蛋白质组学技术研究血吸虫期别差异表达的蛋白，特别是童虫期的差异表达蛋白，对新疫苗和新药物的研制有重要意义，对进一步揭示血吸虫的生长发育和生殖机理也大有裨益，在日本血吸虫童虫发育阶段寻找分子疫苗的靶标是有研究价值的。 中国农业科学院硕士学位论文 研究部分 第 页 研究部分 第一章 日本血吸虫童虫差异表达蛋白质组 的研究 摘要 ： 本研究应 用蛋白质组学 的双向电泳分离技术、质谱分析技术和蛋白质信息学等方法对日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫 (16 日龄 )和成虫（雌 、 雄虫 ， 40 日龄 ） 这两个不同发育时期虫体可溶性蛋白 进行了 分析研究。应用 件分析童虫、雌虫和雄虫的双向 电泳图谱 ，显示三种虫体可溶性蛋白，分别分离到 2000 69、 1100 75 和 1310 18 个蛋白斑点， 这些蛋白斑点大部分 分布 在 0 80 8 的电泳图谱 区域。童虫 蛋白电泳图谱中 呈现 26 2 差异表达 蛋白斑点 ，这些差异表达蛋白主要 参与蛋白信号转导、能量代谢、基因转录、翻译调控和细胞构架构成等。其中某些差异表达蛋白可能与童虫的生长、发育、性别分化等息息相关，加强这些差异表达蛋白的研究可为研究高效的抗抗日本血吸虫病感染分子疫苗或新治疗药物、新诊断抗原提供基础。 关键词 ： 日本血吸虫 童虫差异 表达蛋白 蛋白质组学 前言： 血吸虫发育史复杂， 在不同生长发育时期的血吸虫虫体中，不仅有大量相同的蛋白质表达，也有各期差异蛋白质的表达。目前，对血吸虫期别差异表达蛋白的研究报道很少，对其蛋白质组的研究则更加滞后。因此，应用蛋白质组学技术研究血 吸虫期别差异表达蛋白，特别是童虫期的差异表达蛋白，发现与血吸虫早期发育相关的重要蛋白，对研制开发抗血吸虫感染疫苗、新治疗药物和新诊断蛋白都有重要意义。 料： 1) 新西兰大白兔：健康、体重 2 3 性，购自中科院上海生命科学院实验动物中心。用作日本血吸虫中国大陆株的感染宿主和制备抗体； 2) c 系小鼠： 6龄，雌性，购自中科院上海生命科学院实验动物中心； 中国农业科学院硕士学位论文 研究部分 第 页 3) 日本血吸虫中国