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屠宰场埃希氏大肠菌耐药性的调查研究作者：蓝坚贞 吴聪明 黄睿蕾摘要：本文以美国NCCLS推荐的纸片扩散法调查了某猪屠宰场埃希氏大肠菌对9种常用抗菌药物的耐药性情况。结果从待宰猪、屠体、场内环境及屠宰加工人员分离的大肠杆菌对养猪生产中用作促生长剂的四环素及复方新诺明的耐药率最高，对常用于预防及治疗的氨苄西林、链霉素的耐药率也较突出，而对养猪生产中几乎未使用的头孢氨苄、多粘菌素B的耐药率最低；屠宰加工人员分离菌对9种抗菌药物的耐药率普遍低于另外三类分离菌；待宰猪分离菌对9种抗菌药物耐药率与屠体分离菌有较好的符合率，说明动物源耐药菌可经屠宰污染转移至新鲜肉食品上。关键词：屠宰场；屠体；埃希氏大肠菌；耐药性耐药菌的产生和扩散是一个全球性的大问题，许多国家已开始关注其对公众健康的潜在危害。由于缺乏有关食品动物使用抗菌药物给公众健康带来危害的确切和足够的资料，对兽医上使用抗菌药物尤其是养殖业中大量使用抗生素促生长剂这个问题长期以来争议不休1。为了对细菌耐药性从动物转移到人的危险性作出评价，须从兽医、农业及医疗部门收集有关抗菌药物使用及耐药菌产生发展的标准化、连续性数据，尤其是需要监测分离自食品动物、动物源食品及人体的细菌药物敏感性2，3，4。抗生素的广泛使用，不仅引起病原菌产生耐药性，也会引起条件性致病菌及体内外共生菌产生耐药性。而且共生菌可能还是病原菌耐药基因的贮库，因此共生菌耐药水平是监控抗生素选择压力及预测病原菌耐药性趋势的良好指示器5。食品动物的耐药性共生菌可通过与动物接触及污染食品沿食物链进入人体，因此监测分离自环境、有病及健康动物、动物源食品、有病及健康体的指示菌（如大肠杆菌及肠球菌）对常用抗菌药物的敏感性情况，就可了解细菌耐药性的流行趋势，为耐药细菌或耐药基因从动物和转移到人的危险性评价提供参考数据。由于猪是我国最重要的食品生产动物，因此本文进行了猪屠宰场埃希氏大肠菌耐药性调查，以期获得屠宰场内污染性大肠杆菌的耐药程度及耐药谱等情况，给决策部门、兽医及人医部门提供细菌耐药性的动态资料，为今后开展细菌耐药性研究奠定基础。1材料与方法1.1 试验材料1.1.1培养基 伊红美兰琼脂，批号20011123；普通肉汤，批号20020524；营养琼脂，批号20011215；MH琼脂，批号20020812。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.2肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管 型号 GYZ-11e，批号20020806，购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.3标准菌株 大肠埃希氏菌ATCC25922；金黄色葡萄球菌ATCC25923；铜绿色假单胞菌ATCC27853。均购自杭州天和微生物试剂有限公司。1.1.4 药敏纸片 药物纸片种类及含药量见下表，批号略，购自杭州天和微生物试剂有限公司。购买的每批药物纸片在使用前均按NCCLS1999法规要求用上述3种标准菌株进行质控，符合要求者方可使用，每周用标准菌株ATCC25922进行质控，符合要求者继续使用。表1 各种抗菌药物纸片含药量及判断标准抗菌药物名称纸片含药量（g/片） 抑菌圈判断标准（mm）耐药（R） 中介（M） 敏感（S）氨苄西林101314-1617头孢氨苄301415-1718环丙沙星51516-2021链霉素101112-1415四环素301415-1819氯霉素301213-1718呋喃唑酮3001415-1617复方新诺明23.75/1.251011-1516多粘菌素B30089-11121.2.试验方法1.2.1 标本采集 从待宰猪、屠体、屠宰场（主要是屠宰车间）环境及屠宰加工人员体内分别采样。人体及活猪采集直肠拭子标本，屠体以灭菌棉签擦拭多处位置采集标本，场内环境以灭菌小匙采集表面下层污水及士壤标本。1.2.2菌株的分离 直肠拭子及样本棉签直接在伊红美兰琼脂平板上涂抹，37，24小时培养后，从平板上随机挑取3-5个紫黑色带金属光泽的菌落进行纯培养及生化鉴定。土壤及污水标本先以灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，再从2-3个梯度稀释液中吸取0.1mL倾布于伊红美兰琼脂平板上，37，24小时培养后，挑取大肠杆菌可疑菌落进行下一步操作。1.2.3菌株的鉴定 按杭州天和微生物试剂有限公司介绍的肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管鉴定法进行。即将分离纯化的可疑大肠杆菌菌株接种到系列细菌生化编码微量鉴定管内，37，24小时培养后，对菌株的生化反应结果进行判断并进行编码，按此编码检索肠杆菌科细菌生化编码表即可获得结果，对不确定的菌株进一步补充生化反应予以判定。1.2.4 药敏试验 整个药敏试验严格按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS1999)推荐的纸片扩散法操作程序进行。在营养琼脂平板上挑取单个菌落接种于2ml普通肉汤管内，37培养16-18小时后，用MH肉汤调制菌悬液，使其达到0.5麦氏比浊管浊度。用灭菌棉拭子蘸取已调制好的菌悬液，于管壁上挤去多余液体，在已烘干的MH琼脂平板上均匀涂抹，平皿涂好后放置3-5分钟，待其培养基表面水份吸收干，即用无菌眼科镊将药敏纸片贴于平板上，每种药物贴2个药敏纸片。37培养16-18小时后观察结果，用游标卡尺量取各药2个抑菌圈的直径，计算平均值，参照NCCLS1999列出的标准对抑菌圈的大小作出解释，以敏感、中介或耐药3种形式解释结果。个别NCCLS1999没有列出解释标准的药物（如呋喃唑酮），参照同类相近药物（如呋喃妥因）标准进行解释。2 结果2.1屠宰场分离鉴定出120株埃希氏大肠菌，其中待宰活猪分离16株；屠体分离44株；屠宰加工人员分离33株；屠宰环境分离27株。所有分属各类的大肠杆菌菌株对9种抗菌药物耐药率如表2。从表2可见，待宰活猪、屠体及屠宰环境分离大肠杆菌对四环素都具很高的耐药率，分别为100%、96.3%及95.5%，而屠宰加工人员分离菌对四环素的耐药率只有51.5%；四类分离菌对氨苄西林及复方新诺明的耐药率差异不显著，对链霉素及氯霉素的耐药率，以环境分离菌的耐药率最高，分别为44.4%及40.7%；四类分离菌对头孢氨苄及多粘菌素B的耐药率都较低，而对呋喃唑酮（痢特灵），待宰活猪、屠体及环境分离菌表现出较高的耐药率，屠宰加工人员却很低；对环丙沙星，屠宰环境分离菌没有发现有耐药株，而对其耐药率较高者是待宰活猪，为18.8%，屠宰加工人员分离菌对其耐药率仅为9.1%。另外还应注意到一个问题是有些抗菌药物，如氨苄西林链霉素、氯霉素及痢特灵等分离菌中有许多菌株对它们表现不敏感，有很高中介率。表2 屠宰场分离大肠杆菌对9种抗菌药物的耐药率及中介率（%）药物种类药物简称待宰活猪屠宰环境屠体屠宰人员耐药（R）中介（M）耐药（R）中介（M）耐药（R）中介（M）耐药（R）中介（M）环丙沙星环18.86.307.411.49.19.10氨苄西林氨5037.548.240.747.734.142.427.3头孢氨苄头06.33.77.49.14.563.03.0四环素四100096.33.795.5051.527.3链霉素链31.343.844.418.536.42518.23.0氯霉素氯12.531.340.77.422.713.615.23.0多粘菌素B多6.30004.603.00痢特灵痢2556.337.018.522.743.23.06.1复方新诺明复62.5081.57.472.72.369.702.2 将各类分离株对9种抗菌药物耐药率作折线图，得图1。从图1可观察到，待宰猪与屠体分离大肠杆菌对9种抗菌药物耐药率折线有很高的符合率，而屠宰环境及屠宰加工人员分离菌耐药率折线却与它们表现出差异，尤其是在屠宰环境分离菌对氯霉素耐药率，及屠宰加工人员分离菌对痢特灵耐药率两个折点上，表现出较大差异。2.3 将屠宰场各类分离菌对9种抗菌药物的耐药谱进行归类统计得表3。从表3可见，待宰猪分离菌耐药谱型有13种，屠体分离菌有23种，场内环境分离菌有17种，屠宰加工人员分离菌有10种。各类分离菌中单耐药菌株所占比例均较大，在10%以上，主要是对四环素（t）或复方新诺明（d）耐受。各类分离菌对9种抗菌药物的耐药谱型分布差异较大，但各型耐药谱中，atsd、atd及td却为四类分离菌所共有，且都占分离菌较高比例。待宰猪分离菌中，最多耐药种类为6种，对1-3种抗菌药物耐药的菌株最多；屠宰加工人员分离菌中，最多耐药种类也仅6种，以敏感菌及单耐菌所占比例最高，达24%以上；屠体分离菌中，最多耐药种类达7种，以耐受1-4种抗菌药物的菌株最多；场内环境分离菌最多耐药种类也是7种，以3耐菌株所占比例最大。表3 屠宰场内各类分离大肠杆菌的耐药谱比较待宰活猪屠体场内环境屠宰人员耐药谱型比率耐药谱型比率耐药谱型比率耐药谱型比率catsfd6.25axtslfd 2.27axtslfd3.7catsld9.09catsd6.25atslpfd2.27atslfd7.42axtfd3.03catfd6.25catsld6.82atsld3.7atsld3.03atsd6.25axtpfd2.27tslfd14.82atld3.03tspf6.25atsld2.27atsd3.7atld3.03tsd6.25catfd2.27atsd3.7atsd6.06tld12.5tslfd2.27atld3.7atpd3.03atd6.25axtpf 2.27tsfd3.7atd12.13atd6.25atsd6.82atd14.82td6.06at 12.5atfd2.27tld3.7d24.24tf6.25tsfd4.55tsd3.7中介3.03td6.25ctld2.27tfd3.7敏感24.24t12.5ctsd2.27atl3.7中介0tsld2.27td7.42敏感0atf2.27tf3.7tld2.27at3.7atd9.09t7.42tsd2.27d3.7xtd2.27中介0td13.64敏感0at4.55t15.91d2.27中介0敏感2.30注：c 环丙沙星； a 氨苄西林； x 头孢氨苄； t 四环素； s 链霉素； l 氯霉素；f 呋喃唑酮；p 多粘菌素B； d 复方新诺明；中介 至少对1种抗生素不敏感；敏感 对9种抗生素全敏感3 讨论3.1 屠宰加工企业是肉食品加工及流通的重要环节，也是监控肉食品污染的关键环节。因为在屠宰过程中，畜禽肠道病原菌或共生菌极易引起屠体污染，所以我们常以大肠菌群最近似数作为肉食品卫生判定标准。国外已有不少关于屠体及其它新鲜动物性食品污染菌耐药性的报道6，7，8，但国内还未见有报道。本文以美国NCCLS推荐的纸片扩散法对一个猪屠宰场进行了大肠杆菌耐药性调查，可初步了解我国屠宰场及屠体污染菌的耐药性情况。3.2 调查结果表明，待宰猪、屠体及场内环境分离菌对四环素类及磺胺类抗菌药都表现出很高的耐药率，说明不仅每批屠宰猪都对这两类抗菌药物耐药性都高，而且耐药菌随屠宰污水的长期排放，也使环境中的耐药菌占相当比例。同时，四环素类及磺胺类抗菌药是养猪场最主要的两类饲料添加药物，可能屠宰猪的肠道内容物中有这两类药物的存在，屠宰时随污水排放，也会对环境菌造成耐药性选择压力，长此以往，也会筛选出大量耐药菌株。3.3本次调查发现，待宰猪与屠体分离菌对9种抗菌药物的耐药率分布有较高的符合率，原因可能是屠体污染菌主要来自于屠宰加工过程中动物肠道菌的污染，因此从屠体分离的污染菌应与肠道菌有相似的耐药表现。但屠体分离菌的耐药谱型最多，最复杂，与待宰猪差异较大，说明屠体污染菌的来源不是单一途径，可能还来自于屠宰环境及屠宰加工人员。3.4接受调查的11名屠宰加工人员，2名工作了6年，9名工作了5年，所有调查人至少在6个月内都没有服用过任何抗菌药物。从他们体内分离的大肠杆菌，相较于待宰猪、屠体及场内环境分离菌，对9种抗菌药物的耐药率都要低。该结果说明，只要做好个人卫生，动物源耐药菌通过与动物职业性接触传播给人的机率不大。3.5与许多国外报道相同7,8,9，我们的调查表明，因屠宰而污染新鲜肉食品的大肠杆菌与宰前活畜禽一样，对养殖业中用作促生长剂的抗菌药物及常用预防治疗抗菌药物也会有很高的耐药率。这些耐药性污染菌随着肉品的流通会否转移至人，有待于后面环节的跟踪调查。不过据美国FDA下CVM对恩诺沙星在养禽上使用引起人氟喹诺酮耐药弯曲杆菌感染的危险性评价，在鸡体内诱导产生的氟喹诺酮耐药弯曲杆菌可通过鸡肉感染给人，这个评价结果促使CVM撤消了恩诺沙星在养禽业中的使用10。世界许多国家都非常重视细菌耐药性的监测工作，尤其关注着动物源耐药菌转移给人的潜在危害性。我国在细菌耐药性监测方面所做工作还不多，尤其对动物源细菌耐药性的发生发展资料十分缺乏，今后应加强这方面的工作。【参考文献】1 Mary D Barton and Wendy S Hart.2001.Public Health Risks: Antibiotic Resistance. Asian-Aust. J. Anim. Sci.,14(3):414-4222 World Health Organisation. Report of the WHO Meeting on The Medical Impact of the Use of Antimicrobials in Food Animals,Berlin 13-17 October,1997.3 World Health Organisation. Report of the WHO Meeting on Use of Quinolones in Food Animals and Potential Impact on Human Health:Geneva,2-5 June,1998.4 Clifford Wray, Jean-Claude Gnanou. 2000. Antibiotic resistance monitoring in bacteria of animal origin: analysis of national monitoring programmes. International Journal of Antimicrobial Agents,14:2912945 E. John Threlfall, Linda R. Ward, et al. 2000. The emergence and spread of antibiotic resistance in food-borne bacteria. International Journal of Food Microbiology, 62:156 Heever-LW-van-den. 1972. Antibiotic resistance and R-factors in Escherichia coli from calves, meat and milk. Journal-of-the-South-African-Veterinary-Association., 43(1):71-75.7 Bensink-JC,Frost-AJ,Mathers-W,et al. 1981.The isolation of antibiotic resistant coliforms from meat and s