菌落总数与大肠菌群数测定ppt课件.ppt

菌落总数与大肠菌群数测定,1,主要内容,菌落总数测定大肠菌群测定MPN法原理（拓展内容）,2,菌落总数测定,掌握菌落总数测定方法实验原理不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，36，48h（水产品30，72h），菌落数,3,菌落总数测定,器材与试剂：样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿,4,菌落总数测定,5,倾注培养,6,培养结果,7,菌落总数测定,实验步骤5.菌落计数：肉眼观察，可用放大镜，可标记必要时分区计数，菌落成片者作废计算方法某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值选择菌落数在30-300之间的稀释度（1）仅有一个稀释度在此范围：菌落数稀释倍数,8,菌落总数测定,计算方法：（2）有两个稀释度在30-300之间菌落数之比2，选较小值菌落数之比300取稀释倍数最大者（4）所有稀释度均30取稀释倍数最小者（5）没有任何稀释度在30-300之间选最接近该范围者结果单位：CFU/ml（g）,9,菌落总数测定,注意事项：1.无菌操作2.标记3.何时更换吸管4.吸吹混匀5.琼脂培养基保温6.安全常识,10,大肠菌群数测定,实验目的实验原理36，48h，产气（小倒管）三步法：初发酵、复发酵器材与试剂样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管,11,初发酵,器材与试剂样品、225ml无菌生理盐水、9ml无菌生理盐水、双料LST肉汤，单料LST肉汤，10ml吸管、1ml吸管、吸球,12,大肠菌群数测定,实验步骤：1.初发酵,13,14,15,吸取样品方法,16,加注样品,17,初发酵结果,右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。,18,实验步骤3.复发酵（1）选取产气试管（2）接种至10mlBGLB肉汤中（3）培养：36，48h（4）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。,19,大肠菌群数测定,实验步骤2.分离培养（1）制备伊红美蓝平板：45，无菌，倾注，15ml（2）选产酸产气的发酵管（3）接种至伊红美蓝平板分区划线法（4）培养：36，48h,20,分离培养,器材与试剂初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,21,分区划线法,22,分区划线法,操作要点1.划下一个区前必须灭菌接种环2.划线时接种环同平板呈30-40角3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动,23,大肠菌群数测定,实验步骤2.分离培养：（5）菌落特征：深紫黑色、有金属光泽紫黑色、无或略有金属光泽淡紫红色、中心颜色深（6）革兰染色、镜检：选特征菌落,24,革兰染色法,器材与试剂结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,25,革兰染色法,涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀热固定：通过火焰若干次初染：结晶紫一滴，1min，水洗媒染：卢戈碘液一滴，1min，水洗脱色：95%乙醇，30s或至无色为止复染：复红一滴，30s,26,涂片,27,热固定,28,初染,29,媒染,30,脱色,31,复染,32,革兰氏染色阴性,革兰氏染色阳性,革兰染色法,33,复发酵,器材与试剂培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,34,大肠菌群数测定,实验步骤3.复发酵（1）选取鉴定为无芽孢G-杆菌的菌落1-3个（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液（3）培养：37，24h（4）观察指标：产酸，产气,35,液体接种,36,复发酵,复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生,37,大肠菌群数测定,注意事项：1.无菌操作2.吸管使用3.洗去染液的方法4.显微镜保养5.液体接种,38,MPN法原理,MPN法（MostProbableNumberMethod）目的：对某种细菌进行选择性计数核心思想：泊松分布实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值,39,MPN法原理,MPN法（MostProbableNumberMethod）1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布:P(x=k)=e-xxk/k!x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为：其中C为常系数V为总水样量，x为细菌个数,40,MPN法原理,3.当y(x)max，XMPN4.由于y(x)为单极值函数，令dy/dx=0,即5.解此方程，得x=MPN6.该方程为超越方