体细胞杂交技术在马铃薯抗病育种中的应用

学士学位论文设计文献综述题目体细胞杂交技术在马铃薯抗病育种中的应用姓名薛增苹学号200106035专业园艺指导教师蔡兴奎职称讲师中国武汉二五年五月华中农业大学学士学位论文（设计）1体细胞杂交技术在马铃薯抗病育种中的应用摘要马铃薯是病害侵染十分复杂的作物之一，其中青枯病，晚疫病和病毒病等严重威胁着马铃薯的生产。因此，开展马铃薯抗病育种已成为世界范围内马铃薯育种的一项重要课题。但近年来马铃薯常规育种工作遇到了难以跨越的“生物学路障”，究其原因，主要是现有的栽培品种遗传基础相当狭窄，基本上没有突破普通栽培种（STUBEROSUM）的种质范围，故难以创新。针对马铃薯病害的危害问题，基于抗病育种的特点，利用原生质体融合技术，期望将野生种和原始栽培种的抗病基因转移到当前的栽培品种中，以创造马铃薯的抗病新种质，为常规的抗病育种提供基础材料，探索新的育种技术体系。因此，利用原生质体融合技术得到体细胞杂种的研究，对于创造马铃薯抗病新种质有着非常重要的现实的意义。关键词马铃薯；体细胞杂交；抗病育种常规的抗病育种主要是采用杂交和回交育种手段，是通过雌雄配子结合，实现双亲遗传物质的交换和重组。由于物种间存在杂交不亲和、花期不遇、雌/雄配子不育等生物学障碍，从而限制了优良基因在物种间的自由交流和充分利用（刘继红和邓秀新，1999）。目前的绝大多数抗病品种均是通过常规育种手段选育而成。基因工程技术对定向转移少数基因控制性状，具有很强的目的性，但对于转移多基因控制的性状目前还无能为力。与前两种方法相比，体细胞杂交技术虽然有其随机性的缺陷，但可转移细胞核中的染色体组、染色体片段，或者细胞质基因，使可利用的基因资源十分广泛（高东迎等，2001）。而且体细胞杂交技术以植物体自身的基因为资源，没有潜在的生物安全性危险。马铃薯普通栽培种是同源四倍体作物，杂交时基因分离复杂，有利性状出现频率低，选择效率不高。在马铃薯种间往往存在花期不遇、花器退化、杂交不育、倍性障碍等因素，这在很大程度上限制了抗性基因在马铃薯种间的重组。而体细胞杂交技术是获得杂种植株的理想方法（舒常亲，1995）。1体细胞杂交技术的研究与应用体细胞杂交是植物细胞杂交技术中应用最为广泛的融合方式，根据融合前亲本原生质体是否经过处理又可分为对称融合和非对称融合，由此能够产生三种类型的体细胞杂种，即综合了双亲全部遗传物质的对称杂种；部分遗传物质发生丢失的非对称杂种（ASYMMETRICHYBRID）和只有融合双亲一方核物质的胞质杂种（阎静等,2004）。据不完全统计，全世界范围内通过体细胞杂交技术已获得的杂种植株超过200多种，这些杂种绝大部分为草本植物（舒常庆，1995）。早期的体细胞杂交研究主要集中于茄科植物，随后又广泛应用于十字花科芸薹属（BRASSICA）和拟南芥属（ARABIDOPSIS）以及伞形科的胡萝卜属（DAUCUS）。20世纪80年代中期以后，随着一批重要经济农作物和经济木本植物，如水稻、大豆、小麦、柑桔、樱桃、杨树等的原生质体培养相继获得成功（许智宏，1997），目前具有重要经济价值植物的体细胞杂交研究已成为该领域的主流。2马铃薯的抗病种质及其在体系胞杂交育种技术中的有效利用马铃薯植物包含有丰富的野生种和原始栽培种，现已鉴定出8个原始栽培种和228个野生种。这些野生资源具有对病害、虫害、霜冻、干旱、病毒病等广泛的抗性，如野生种STORVUM具有对黄萎病，根瘤病和线虫的抗性；野生种SDEMISSUM不仅具有对晚疫病的垂直抗性，而且高抗马铃薯卷叶病毒（PLRV）；野生种SBREVIDENS几乎高抗或免疫马铃薯X病毒（PVX）、Y病毒（PVY）、马铃薯卷叶病毒（PLRV），并具有耐霜冻等优良基因；野生种SCHACOENSE、SMICRODONTUM、SSTENOTOMUM和原始栽培种SPHUREJA具有细菌性青枯病的抗性基因（TUNGETAL，1990），这些野生资源都是用于改良现有马铃薯栽培品种的宝贵资源。由于马铃薯野生种和原始栽培种大多数为二倍体（2N2X24），而普通栽培种为四倍体（2N4X48），两者之间存在倍性水平和胚乳平衡数（ENDOSPERMBALANCENUMBER，EBN）的差异，直接杂交很难成功，限制了野生资源中优良基因的利用（司怀军和王蒂，2003）。华中农业大学学士学位论文（设计）2体细胞杂交技术为马铃薯育种开辟了一条新途径。利用体细胞杂交技术，将有性杂交困难的亲本进行原生质体融合，使野生资源中的优良基因转移到栽培品种中，不仅在一定程度上克服有性杂交不亲和的障碍，扩大马铃薯种质范围，而且能够实现线粒体和叶绿体等胞质基因控制的性状转移和重组（孙勇如，1991；颜昌敬和张玉华，1995）。特别是在转移多基因控制的农艺性状、品质性状、抗逆性状等方面，体细胞杂交技术显得更为有效。所以，细胞工程育种技术已成为利用马铃薯野生资源、创造新种质乃至培育新品种的重要育种手段（戴朝曦等，1998）。3体细胞杂交技术与马铃薯抗病育种常规的抗病育种主要是采用杂交和回交育种手段，目前的绝大多数抗病品种均是通过常规育种手段选育而成（陈锋等，1990）。但马铃薯普通栽培种是同源四倍体作物，杂交时基因分离复杂，有利性状出现频率低，选择效率不高。在马铃薯种间往往存在花期不遇、花器退化、杂交不育、倍性障碍等因素，这在很大程度上限制了抗性基因在马铃薯种间的重组。而体细胞杂交技术是获得杂种植株的理想方法（程肖蕊等，1996）。31体细胞杂交与马铃薯抗青枯病育种马铃薯抗青枯病育种一直进展缓慢，主要原因是一、青枯病病原菌与寄主植物间的相互作用机制复杂，目前尚未明确；二、广泛缺乏青枯病的抗源材料，马铃薯四倍体栽培种中完全没有青枯病的抗源，自然界中尚未找到对马铃薯青枯病具有免疫性的植物抗源材料，这可能是由于青枯菌适应性强，变种、小种变异多，寄主植物难以发展起有效的抗病性（李广存等，2004）。FRENCH和LINDO（1982）等认为，至少有三个不连锁的显性基因参与了青枯病抗性控制。GRIMLEY和HANSON（1998）也认为，至少有四个主效基因参与了马铃薯抗青枯病反应。对于转移这种多基因控制的性状，运用体细胞杂交技术将更为有效。LAFERRIERE等（1999）利用野生种SCOMMERSONII与栽培种双单倍体融合，再生的杂种植株其抗性水平显著高于感病对照品种ATLANTIC和SUPERIOR。FOCK等（2000）利用原始栽培种SPHUREJA与栽培种双单倍体进行融合，再生的体细胞杂种及其亲本植株进行室内青枯菌接种鉴定，结果表明，体细胞杂种植株对青枯菌生理小种1号和3号菌株均具有明显的抗性，其中杂种株系BP9的抗性水平显著高于抗性亲本SPHUREJA。FOCK等（2001）利用野生种SSTENOTOMUM与栽培种融合也得到了类似的结果。我国的戴朝曦等（1994）利用栽培种的双单倍体系8115与SPHUREJA、SCHACOENSE的实生籽分离原生质体，分别进行融合，获得了实生籽来源的体细胞杂种植株结果表明，所获得的体细胞杂种植株对清枯病具有不同的抗性水平。32体细胞杂交与马铃薯抗晚疫病育种在马铃薯晚疫病抗性育种中，应用最多的是野生种SDEMISUM（2N6X72），其晚疫病抗性水平高，抗性易于转移，世界各国的马铃薯晚疫病抗性栽培种几乎都掺有其抗性基因，目前仍然是一个很有利用价值的抗源。其它的一些野生种，例如SSTOLONIFERUM、SPOLYADENIUM、SPOLYTRICHON、SBULBOCASTANUM、SMICRODONTUM、SCIRCAEIFOLIUM、SCOMMERSONII、SVERRUCOSUM、SPINNATISECTUM、SCHACOENSE、SVERNEI等具有从垂直抗性到水平抗性的抗晚疫病性状，它们之中既包含有主效R基因，又具有微效多基因。若能实现这些野生种中的抗性基因转移，将大大加速马铃薯抗病育种进程。利用体细胞杂交技术，将野生种SCIRCAEIFOLIUM、SPINNATISECTUM和SBULBOCASTANUM分别与马铃薯栽培种融合，再生植株的分子标记检测证明为双亲的融合杂种。HELGESON等（1998）运用PEG诱导野生种SBULBOCASTANUM（2N2X24）与普通栽培种STUBEROSUM（2N4X48）的叶肉原生质体融合，获得了六倍体（2N6X72）体细胞杂种，再与栽培种KATAHDIN或ATLANTIC杂交和回交，通过4年的田间评价，筛选到对晚疫病具有高度抗性的株系。华中农业大学学士学位论文（设计）333体细胞杂交与马铃薯抗病毒育种病毒是造成马铃薯品种退化的主要因素，病毒病不仅降低马铃薯的产量，同时也影响马铃薯的质量。据调查大约有23个病毒和类病毒可侵染马铃薯，其中危害最大的病毒主要有马铃薯Y病毒（PVY）、X病毒（PVX）、S病毒（PVS）、M病毒（PVM）、卷叶病毒（PLRV）和纺锤块茎类病毒（PSTV）（吕晓波和刘丹宁，2001）。尽管利用脱毒种薯控制病毒病的蔓延和危害被证明是最有效的途径（柳俊和谢从华，1998），但抗病品种具有抗性稳定，使用方便以及生产成本低等优势，长期以来抗病毒病育种一直是人们关注的焦点。自80年代初，BUTENKO和KUCHKO（1980）将二倍体马铃薯野生种SCHACOENSE与栽培种进行融合，获得了抗马铃薯Y病毒的杂种植株，后来的研究者通过体细胞杂交技术获得了抗马铃薯主要病毒病的杂种株系，利用野生种SBREVIDENS抗PVX、SBERTHAULTII抗PVY、SCHACOENSE抗PVS、SCHACOENSE抗PVM、SVERRUCOSUM抗PLRV和SACAULV抗PVXB均获得了具有相应抗性杂种株系，而且部分杂种株系能够同时具有多种病毒的抗性。NOVY和HELGESON（1994）获得的STUBEROSUMSBERTHAULTIISETUBEROSUM的融合杂种几乎全部高抗PVY，抗性水平显著高于融合亲本和感病对照品种，回交后代中出现了抗PVY抗性分离，说明PVY的抗性是由单基因或主效寡基因控制。4体细胞杂交技术抗病育种的评价与展望马铃薯体细胞杂交研究经过不断发展已取得可喜的进步，获得了大量的种内、种间、属间，甚至科间的体细胞杂种。但是从应用状况上分析，该技术还不够成熟，实际应用该技术进行马铃薯遗传改良，抗病育种还处于理论研究阶段。首先表现在体细胞杂交技术与原生质体培养技术一样，受基因型的影响较大，现有许多研究认为亲本的基因型选择对原生质体融合效率、再生愈伤组织分化以及植株的再生能力等均存在较大影响（COLEMANETAL，1991）。在大量马铃薯原生质体融合成株的报道中，大多数的研究者选用了马铃薯野生种SBREVIDENS作为融合亲本之一，一是因为该种具有高抗或免疫马铃薯多种病毒、耐霜冻、抗晚疫病等多种优良性状，二是因为该种的原生质体培养研究较多，利用该种作为亲本其原生质体融合培养效率较高。植物体细胞杂交技术的迅速发展极大地推进了作物育种的进程。近十年来，一大批种间，属间体细胞杂种的获得，在实现远缘遗传重组，克服有性杂交不亲和性，创造新类型植物方面向前迈出了一大步。胞质杂交技术体系的不断完善。明显拓宽了体细胞杂交组合的种属范围，提高了杂种植株的再生能力和可育程度，推动了胞质基因控制的性状的转移和利用。通过体细胞杂交技术转移抗性性状和抗病基因，及进行作物间优良农艺性状组合的可能性不仅在马铃薯上得到应用，已在许多作物中变为现实，油菜，烟草，水稻及柑桔等的体细胞杂种的一些后代已应用于常规育种与生产实践。今后在利用体细胞杂交进行植物育种工作中，抗性育种仍然是重大课题；重要农艺性状优良基因得转移和组合，尤其是高光效育种等，将是作物品质改良的重要内容；利用配子体细胞杂交培育三倍体无核品种是果品育种的新方向（舒常庆，1995）。总之，体细胞杂交这一现代育种手段必将使一批又符合人们要求的优良品种作物从未来的研究中走向现实。参考文献1司怀军，王蒂马铃薯种间体细胞杂种植株的育性和遗传改良作物学报，2003，29（2）2802842刘继红，邓秀新植物原生质体非对称融合及其在育种上的应用生命科学,1999,11增刊3吕晓波，刘丹宁马铃薯抗病毒育种的研究进展中国马铃薯，2001，15（1）31334孙勇如植物原生质体融合与体细胞杂交植物原生质体培养，北京科学出版社，1991，22235许智宏植物原生质体研究的历史和现状见许智宏，卫志明植物原生质体培养和遗传操作上海上海科技出版社，1997，26华中农业大学学士学位论文（设计）46李广存，金黎平，谢开云，屈东玉马铃薯青枯病研究进展中国马铃薯，2004，18（6）3503547陈锋，肖增宽，玉凤义，李景华马铃薯新型栽培种（NEOTUBEROSUM）双单倍体杂种的研究马铃薯杂志，1990，48138柳俊，谢从华马铃薯种薯退化与试管薯应用技术长江蔬菜，1998，8149高东迎，黄雪青，孙立华水稻体细胞杂交研究进展生物工程进展，2001，213384110阎静，张明方，陈利萍体细胞杂交技术在蔬菜育种中的研究与应用细胞生物学杂志，2004，261515611程肖蕊，杨松涛，李彦舫原生质体培养在作物改良中的应用吉林农业大学学报，1996，18增刊717312舒常庆体细胞杂交在植物育种中的应用研究进展经济林研究，1995，134697213颜昌敬，张玉华植物原生质体培养和融合在育种上的应用农业科学集刊第二集，1995，515616214戴朝曦，冉毅东，王清，孙顺娣，于品华，曲秀兰细胞工程技术在马铃薯育种中的研究遗传HEREDITASBEIJING，1998，20增刊394215戴朝曦，孙顺娣，李继红马铃薯体细胞电融合技术的研究兰州大学学报（自然科学版），1994，30828716BUTENKOR,KUCHKOASOMATICHYBRIDIZATIONSOFSTUBEROSUMANDSCHACIENSEBYPROTOPLASTFUSIONINFERENVZYL,FARKASGLEDS,ADVANCESINPROTOPLASTRESEARCHBUDAPESTAKADEMIAIKIADOPRESS,1980,29330017COLEMANM,DAVIEP,VESSEYJ,POWELLWINTRACLONALGENETICVARIATIONFORPROTOPLASTREGENERATIONABILITYWITHINSOLANUMTUBEROSUMCVRECORDANNBOT,1991,6745946118FOCKI,COLLONNIERC,LUISETTIJ,PURWITOA,SOUVANNAVONGV,VEDELF,SERVAESA,AMBROISEA,KODJAH,DUCREUXG,SIHACHAKRDUSEOFSOLANUMSTENOTOMUMFORINTRODUCTIONOFRESISTANCETOBACTERIALWILTINSOMATICHYBRIDSOFPOTATOPLANTPHYSIOLBIOCHEM,2001,3989990819FOCKI,COLLONNIERC,PURWITOA,LUISETTIJ,SOUVANNAVONGV,VEDELF,SERVAESA,AMBROISEA,KODJAH,DUCREUXG,SIHACHAKRDRESISTANCETOBACTERIALWILTINSOMATICHYBRIDSBETWEENSOLANUMTUBEROSUMANDSOLANUMPHUREJAPLANTSCI,2000,16016517620FRENCHER,DELINDOLRESISTANCETOPSEUDOMONASSOLANACEARUMINPOTATOSPECIFICITYANDTEMPERATURESENSITIVITYPHYTOPATHOLOGY,1982,721408141221GRIMLEYN,HANSONPGENETICSOFPLANTRESISTANCETOBACTERIALWILTROUNDTABLEREPORTINPRIORP,ALLENC,ELPHINSTONEJEDS,BACTERIALWILTDISEASE,MOLECULARANDECOLOGICALASPECTSBERLINSPRINGER,1998,26326622HELGESONJP,POHLMANJD,AUSTINS,HABERLACHGT,WIELGUSSM,RONISD,ZAMBOLIML,TOOLEYP,MCGRATHJM,JAMESRV,STEVENSONWRSOMATICHYBRIDSBETWEENSOLANUMBULBOCASTANUMANDPOTATOANEWSOURCEOFRESISTANCETOLATEBLIGHTTHEORAPPLGENET,1998,9673874223LAFERRIERELT,HELGESONJP,ALLENCFERTILESOLANUMTUBEROSUMSCOMMERSONIISOMATICHYBRIDSASSOURCESOFRESISTANCETOBACTERIALWILTCAUSEDBYRALSTONIASOLANCEARUMTHEORAPPLGENET,1999,981272127824NOVYRG,HELGESONJPRESISTANCETOPOTATOVIRUSYINSOMATICHYBRIDSBETWEENSOLANUMETUBEROSUMANDSTUBEROSUMSBERTHAULTIIHYBRIDTHEORAPPLGENET,1994,8978378625TUNGPX,RASCOET,ZAAGPV,SCHMIEDICHEPRESISTANCETOPSEUDOMONASSOLANACEARUMINTHEPOTATOIEFFECTSOFSOURCESOFRESISTANCEANDADAPTATIONIIASPECTSOFHOSTPATHOGENENVIRONMENTINTERACTIONEUPHYTICA,1990,45203215华中农业大学学士学位论文（设计）5学士学位论文题目马铃薯体细胞杂种室内青枯病抗性鉴定姓名薛增苹学号200106035专业园艺指导教师蔡兴奎职称讲师中国武汉二五年五月目录摘要关键词华中农业大学学士学位论文（设计）6ABSTRACTKEYWORDS1前言2材料与方法21实验材料822实验方法8221植物材料与病原菌的繁殖8222青枯菌的分离8223青枯菌生化小种鉴定9224体细胞杂种的室内伤根接种9225数据处理93结果与分析31青枯菌的生化和生理小种鉴定结果932杂种植株及其亲本的发病过程1033体细胞杂种植株的抗性水平及其抗性分布1134体细胞杂种植株抗病性水平的方差分析124讨论41体细胞杂交技术在作物遗传改良中的有效性与可行性1342体细胞杂种青枯病抗性差异及其原因1443青枯病抗性室内接种技术评价14参考文献致谢马铃薯体细胞杂种室内青枯病抗性鉴定摘要青枯病（RALSTONIASOLANACEARUM）是一种重大的细菌性病害，在热带、亚热带、部分温带、甚至一些冷凉地区普遍发生，寄主范围涉及50多个科的200多种植物，尤其易侵染马铃薯和番茄。本研究以青枯菌生理小种1号菌株对马铃薯栽培种中薯二号的无性系8和野生种SCHACOENSE融合产生的体细胞杂种及其亲本植株进行室内伤根接种，试验表明，体细胞杂种株系具有从高度感病到高度抗病等一系列不同程度的抗性水平。约58的体细胞杂种重组了野生种的青枯病抗性基因。50个体细胞杂种株系的抗病性方差分析表明，有28的株系比野生种SCHACOENSE更抗或更耐青枯菌生理小种1号菌株，30华中农业大学学士学位论文（设计）7的株系其抗性水平与野生种SCHACOENSE没有显著差异，6的株系其抗性水平介于两融合亲本之间。另有36的杂种株系其抗性水平与栽培种亲本没有显著差异。关键词马铃薯；体细胞杂种；抗性鉴定；青枯病THERESISTANCEIDENTIFICATIONINVITROOFBACTERIALWILTINPOTATOINTERSPECIFICSOMATICHYBRIDSABSTRACTBACTERIALWILT,ASEVEREANDDEVASTATINGPLANTDISEASECAUSEDBYRALSTONIASOLANACEARUM,OCCURSWIDELYINTROPICAL,SUBTROPICAL,WARMTEMPERATEAREASANDEVENINSOMECOOLREGIONSITAFFECTSMORETHAN200PLANTSPECIESDISTRIBUTEDOVER50FAMILIES,PARTICULARLYPOTATOESANDTOMATOESPROVINGBACTERIALWILTRESISTANCEOFTHESOMATICHYBRIDSFROMPOTATOCLONES8ANDSCHACOENSEBYTHEINOCULATIONOFTHEPATHOGENINVITROTHERESULTSSHOWEDTHATTHESOMATICHYBRIDSDISPLAYEDDIFFERENTRESISTANCELEVELSVARYINGFROMHIGHRESISTANCETOHIGHSUSCEPTIBILITYTORACE1OFRSOLANACEARUMTHEREWEREABOUT58OFTHESOMATICHYBRIDSRECOMBINEDBACTERIALWILTRESISTANCEGENESORIGINALLYFROMTHEWILDSPECIESTHEANOVATESTOF50SOMATICHYBRIDLINESSHOWEDTHAT28OFTHEHYBRIDSEXHIBITEDSTRONGERRESISTANCEORTOLERANCEAGAINSTRACE1OFRSOLANACEARUMAND30DISPLAYEDNOSIGNIFICANTDIFFERENCEWHENCOMPAREDWITHTHERESISTANCEPARENT,SCHACOENSETHEREWERE6OFTHEHYBRIDSHADMODERATERESISTANCELEVELBETWEENTHEPARENTSWHILEANOTHER36SHOWEDNOSIGNIFICANTDIFFERENCEFROMTHESUSCEPTIBLECULTIVATEDPARENTKEYWORDSPOTATOSOMATICHYBRIDRESISTANCEIDENTIFICATIONBACTERIALWILT1前言马铃薯（SOLANUMTUBEROSUML）是世界上是仅次于玉米、水稻和小麦的第四大粮食作物，在许多国家还是主要的蔬菜作物之一。不仅具有重要的经济价值，同时也是植物生物学基础研究的重要模式植物。目前，我国马铃薯种植面积已达到470多万HM2，是世界第一大马铃薯生产国（屈冬玉等，2003）。在过去20年间，发展中国家的马铃薯生产几乎翻了一番，产量急剧上升，而玉米、小麦、水稻的增长速度却在减缓，马铃薯已在构筑世界食品安全中充当了重要角色。因此，发展我国的马铃薯生产具有重要的战略意义。由茄科雷尔氏菌（RALSTONIASOLANACEARUM）引起的细菌性病害是马铃薯毁灭性病害，严重威胁着马铃薯的生产（李广存等，2004）。RSOLANACEARUM可以侵染50多个科的200多种植物，特别是茄科的马铃薯和番茄。在大多数热带、亚热带、温带，甚至一些冷凉地区普遍发生。在我国，20世纪50年代末期，青枯病只在烟草、番茄、辣椒等少数作物上发生，分布范围也仅限于长江流域及其以南地区，但到了80年代，此病已在17个省（市、自治区）的20多种栽培植物上普遍发生，分布地域向北延伸直至内蒙、宁夏等省区（何礼远和康耀卫，1995）。由于在马铃薯生产上对青枯病的防治还没有特殊的化学药剂，综合防治技术虽然可以起到一定积极作用，但难以大面积推广，因此，青枯病的抗病育种已成为世界范围内马铃薯育种的一项重要课题。展望当今世界以及前人的研究成果，马铃薯青枯病的抗性种质资源研究表明，当前的四倍体马铃薯普通栽培种中广泛缺乏青枯病抗源，而在野生种SCHACOENSE、SMICRODONTUM以及原始栽培种SPHUREJA等野生资源中存在青枯病的抗性或耐病基因（TUNGETAL，1990）。早期在对原始栽培种SPHUREJA的抗青枯病基因进行研究中发现，至少有三个不连锁的显性基因参与了青枯病抗性控制，近来，GRIMLEY和HANSON（1998）认为，至少有四个主效基因参与了马铃薯抗青枯病反应。实践证明，对于转移这些多基因控制的性状，应用原生质体融合技术将更加快捷和有效。长期以来，马铃薯育种一直采用品种间杂交育种和芽变选种的方法选育新品种（戴朝曦，1993），但由于栽培种马铃薯一般是四倍体无性繁殖作物，育种中存在许多困难，包括高度的细胞杂和性，基因分离复杂，花粉不育，以及现有栽培种基因库狭窄，缺乏抗病和抗逆性基因；又因为受倍性水平差异限制，无法与具有丰富基因资源的野生种质（75左右为二倍体）进行有性杂交（戴朝曦和李品华，华中农业大学学士学位论文（设计）81990），限制了野生种质在作物改良上的应用。原生质体融合技术在一定程度上克服了有性杂交育种上的障碍（奚元龄和颜昌敬，1992），使不能通过有性杂交的亲本之间进行遗传物质的重组，不仅包括核基因的重组，也包括胞质基因的重组（孙勇如，1991；阎静等，2004）。FOCK等（2000）利用原生质体融合技术，将野生种SCOMMERSONII和原始栽培种SPHUREJA分别与栽培种双单倍体融合，获得了部分四倍体的抗青枯病杂种株系，成功地实现了抗性基因从野生种到栽培种的转移。在国内，1994年戴朝曦等利用实生籽的子叶和下胚轴作为原生质体分离材料，也首次获得了体细胞杂种植株。并对它们的体细胞杂种植株从形态学、细胞学和同工酶等方面作了详细的鉴定（司怀军和戴朝曦，1997），获得了一些在植株生长势、产量以及薯形等农艺性状方面均优于亲本的体细胞杂种株系。但是也有研究认为，马铃薯野生种与栽培种或野生种与栽培种双单倍体进行原生质体融合，再生的体细胞杂种中，野生种的核基因或染色体容易优先缺失（PIJNACKERETAL，1987），从而并不表现出野生种中的抗病性性状，所以对体细胞杂交技术得到的杂种植株，需进行抗性评价。本实验的目的是对马铃薯栽培种“中薯二号”的无性系8与野生种SCHACOENSE叶肉原生质体融合再生的体细胞杂种植株，进行青枯病抗性评价，利用青枯病生理小种1号对体细胞杂种及其亲本的试管苗进行伤根接种，筛选出具有青枯病抗性的杂种株系，为马铃薯抗青枯病常规育种提供材料来源和技术支持。2材料与方法21实验材料植物材料为马铃薯栽培种“中薯二号”的无性系8与野生种SCHACOENSE叶肉原生质体融合再生的体细胞杂种植株，由华中农业大学马铃薯课题组提供。无性系8为栽培品种“中薯二号”经授粉诱导孤雌生殖产生的双单倍体，在继代培养过程中发生自然加倍。野生种SCHACOENSE具有青枯病抗性基因，为融合的抗性亲本。体细胞杂种的具体株系见表32。病原菌材料从感染青枯病植株中分离，为青枯菌生理小种1号，生化小种3号菌株。22实验方法221植物材料与病原菌的繁殖植物材料的繁殖体细胞杂种及其亲本材料均采用单茎段繁殖，培养基为MS基本培养基附加4蔗糖和08琼脂，PH58。培养条件为温度201、光照16H/D、光强30004000LX、相对湿度60左右。病原菌的繁殖挑取单菌落，在青枯菌分离的基本培养基上划线扩繁。222青枯菌的分离青枯菌的分离是依据国际马铃薯中心（CIP）1996年汇编的青枯病操作手册进行，略作改动。分离工作是依据青枯菌在TTC（2，3，5氯化三苯基四氮唑）的培养基上显红色反应进行，所用的基本培养基配方见表21。TTC母液配制称取1GTTC溶于100ML蒸馏水中，过滤灭菌，保存于4的棕色试剂瓶中备用。青枯菌分离时，将基本培养基加热融化后冷却至60左右，加入TTC母液，使TTC的终浓度达0005（W/V），充分混匀后，每培养皿（直径9CM）倒入20ML培养基，凝固后倒置存放12D，使表面干燥，封口备用。本实验所用青枯菌来源于发病植株（南方马铃薯研究中心提供），选择发病植株薯块用自来水洗净，然后削去表皮，挑选维管束发黑的薯块部分，切碎后有白色菌脓流出，在无菌水中浸泡20MIN。取200L的菌液按10倍稀释梯度涂皿，置于28恒温培养箱中培养12D后，挑取圆形、中间浅红色、周围呈一圈白色轮纹状的菌斑，在不含TTC的同种培养基上划线培养，随机挑取5个单菌落扩繁，用于青枯病生化小种鉴定，单菌落编号依次为菌1、菌2、菌3、菌4和菌5。表21分离青枯菌的基本培养基TABLE21BASICMEDIUMSFORISOLATINGRALSTONIASOLANACEARUM成分INGREDIENT名称NAME用量DOSAGE（G）DEXTROSE葡萄糖25PEPTONE蛋白胨100华中农业大学学士学位论文（设计）9CASAMINOACIDS（DIFCO）水解酪蛋白氨基酸10AGAR琼脂180WATER（DISTILLED）蒸馏水10L223青枯菌生化小种鉴定按照表22的配方，称取各成分溶于1L蒸馏水中，用40（W/V）NAOH溶液调节PH值至7071，于121高温灭菌20MIN。青枯菌的鉴定是依据青枯菌对甘露醇、山梨醇、乳糖和麦芽糖等碳水化合物的利用和分解情况来判断，用BROMOTHYMOLBLUE（溴百里香酚蓝）为指示剂，其中指示剂在7071中性培养基中显兰色。当青枯菌利用或氧化碳水化合物时，将产生酸类物质使培养基的PH值下降，当PH值低于60时，培养基显黄色，说明青枯菌已经利用或分解这些碳水化合物，反之亦然。表22青枯菌鉴定的基本培养基TABLE22BASICMEDIUMSFORIDENTIFYINGRALSTONIASOLANACEARUM成分INGREDIENT名称NAME用量DOSAGE（G）NH4H2PO4磷酸二氢铵10MGSO47H2O七水硫酸镁02KCL氯化钾02PEPTONE蛋白胨10BROMOTHYMOLBLUE溴百里香酚蓝003AGAR琼脂30WATERDISTILLED蒸馏水10L实验设计为以10甘露醇、10山梨醇、10乳糖、10麦芽糖和等量的无菌水为空白对照（CK）5个处理，每个处理设置2次重复。碳水化合物的准备，称取各成分5G，分别溶于50ML蒸馏水，由于二糖类物质热不稳定，需过滤灭菌，其它物质均采用110的高温灭菌30MIN。青枯菌生理生化小种鉴定时，将200ML基本培养基加热熔化后冷却至60左右，加入50ML灭菌好的各碳水化合物，摇匀后平均分装于10支试管，平均每管约25ML，对照处理为50ML的无菌水。以108个/ML的菌液浓度每管接种100L，封口后，置于28恒温培养箱中培养。224体细胞杂种的室内伤根接种以青枯菌生理小种1号、生化小种3号菌株进行体细胞杂种及其亲本的室内伤根接种。在28条件下培养48H的菌株，用无菌水清洗，用分光光度计检测菌液浓度，以OD600NM01，即108CFU/ML的菌液浓度接种。接种方法体细胞杂种植株及其亲本的试管苗植株接种在MS基本培养基附加4蔗糖和08琼脂上（PH58），每盒接种9株，试验设计4次重复，同时，每个株系以等量的无菌水接种为对照，因此每个株系各5盒。生长4W时，用无菌的手术刀伤根，每盒接种3ML菌液，然后置于温度201、光照16H/D、光强30004000LX、相对湿度60左右的培养室中继续培养。接种后每隔3D观察记录一次植株的发病情况和发病程度。以接种一个月时的观察记录结果进行统计分析，依据发病情况的严重程度分为04五个等级，0完全无叶片萎蔫；1125叶片萎蔫，22650叶片萎蔫；35175叶片萎蔫；475以上叶片萎蔫。病情指数参照WINSTEAD和KELMAN（1952）的方法计算，病情指数（DI，DISEASEINDICES）（每个病级的植株数级别数）/（总植株数4）；完全萎蔫的植株率（）指完全萎蔫的植株数占接种植株总数的百分率。225数据处理根据实验设计应用相关的统计工具如EXCELL、SAS等对试验数据进行方差分析，并对处理间数据作显著性分析。3结果与分析31青枯菌的生化和生理小种鉴定结果华中农业大学学士学位论文（设计）10分离的青枯菌在鉴定培养基上培养7D后，依据培养基的颜色变化，判断碳水化合物的利用情况，结果列于表31。从表中可以看出，来自南方马铃薯研究中心的病菌为生化小种3号菌株，可侵染马铃薯和番茄，属于生理小种1号菌株。该小种为番茄的优势小种，也可以引起马铃薯植株发病。表31依据对碳水化合物的利用情况鉴定青枯病病菌的生化小种TABLE31CLASSIFICATIONOFRSOLANACEARUMINTOBIOVARSBASEDONTHEABILITYTOUTILIZECARBOHYDRATES处理菌1菌2菌3菌4菌5无菌水（CK）甘露醇山梨醇乳糖麦芽糖生化小种33333生理小种11111注“”表示青枯菌对碳水化合物能够消化利用，“”表示不能消化利用。NOTE“”INDICATEDTHATRSOLANACEARUMCOULDUTILIZECARBOHYDRATES,AND“”INDICATEDCOULDNOT,RESPECTIVELY32杂种植株及其亲本的发病过程青枯病的致病机理青枯菌通常从植物根部或茎部的伤口侵入，直接进入导管系统，引起发病，但在天然条件下，也能从没有受伤的次生根的根冠部位侵入。植物生长时在次生根的根冠和主根的表皮间形成鞘，青枯菌可以穿过这层鞘，侵入皮层于细胞间隙生长，破坏细胞间中胶层，使细胞质壁分离、变形形成空腔，进一步侵染木质部的薄壁组织，使导管周围的小细胞受到刺激形成侵填体（TYLOSES），移入并破坏侵填体，释放进入导管，并在导管内大量增殖和快速扩张，从而堵塞导管，阻碍了水分运输，引起植株萎焉和死亡（何礼远和康耀卫，1995）。马铃薯感病后，叶片自下而上逐渐萎垂，45天后全株茎叶呈水浸状萎蔫死亡，但茎叶色泽仍为青绿色（李文生，1998）。在各株系经过伤根接种处理一周后，对各株系体细胞杂种植株进行每隔3天的定期观察，观察发现有包括无性系亲本8在内的11个株系发病较早，在接种一周后即开始陆续发病，除无性系亲本8外，其它10个体细胞杂种株系为8C441、8C172、8C113、8C621、8C22、8C64、8C253、8C131、8C572和8C561。另外，在以上10个体细胞杂种株系当中有6个株系8C441、8C172、8C113、8C621、8C22和8C64较栽培种无性系亲本8更早的开始发病，这一现象说明了这6个体细胞杂种株系比栽培种感病亲本更容易感病，并更早的开始发病。除以上各体细胞杂种株系外，其余的各感病株系基本都在两周以后才开始陆续有症状出现。伤根接种30天时，各株系的发病症状已基本稳定，此时对所有体细胞杂种株系和两个亲本进行完全统计，体细胞杂种植株及其亲本对青枯菌生理小种1号，生化3号菌株表现出抗性差异。抗病或耐病的株系只有少数叶片发生萎蔫，如野生种亲本SCHACOENSE和体细胞杂种株系8C221，它们的发病程度较轻或者完全正常，见图1（A，C）。而感病植株如栽培种亲本无性系8和体细胞杂种植株8C441，植株几乎全部萎蔫，见图1（B，D）。华中农业大学学士学位论文（设计）11ACBD图1体细胞杂种及其亲本植株利用青枯菌生理小种1号菌株室内伤根接种30D时的发病情况A抗性亲本野生种SCHACOENSE；B感病亲本栽培种无性系8；C抗病的杂种株系8C221；D感病的杂种株系8C441FIG1PLANTMORPHOLOGYOFSOMATICHYBRIDSANDTHEIRPARENTSON30DAYSAFTERROOTINOCULATIONBYRACE1STRAINOFRSOLANACEARUMARESISTANTPARENTWILDSPECIESSCHACOENSE；BSUSCEPTIBLEPARENTCULTIVATEDPOTATOCLONES8；CHIGHLYRESISTANTSOMATICHYBRID8C221；DHIGHLYSUSCEPTIBLESOMATICHYBRID8C44133体细胞杂种植株的抗性水平及其抗性分布实验对组合8SCHACOENSE的50个杂种株系及其两个亲本进行了青枯菌生理小种1号菌株伤根接种试验，各体细胞杂种植株的抗性水平列于图2。从图中可以看出，由野生种SCHACENSE与栽培种无性系8融合产生的体细胞杂种植株，其对青枯菌生理小种1号的抗性表现出明显差异，具有从高度感病到高度抗病等一系列不同抗性程度的株系，部分杂种株系表现出比对照抗性亲本野生种SCHACOENSE更抗病，部分杂种株系却表现出比感病亲本“中薯二号”无性系8提前发病，也有一些中度抗病或中度感病的杂种株系，体细胞杂种植株的群体抗病性是呈一系列连续分布的。而采用无菌水处理的对照植株则完全正常。在被检测的50个8SCHACOENSE杂种植株中，有11个株系8C561、8C611、8C621、8C51、8C64、8C113、8C131、8C71、8C631、8C601和8C441表现出和8一样完全感病，表现出完全萎蔫，占被检测植株的220；另有25个株系8C102、8C173、8C541、8C62、8C311、8C102、8C201、8C422、8C381、8C192、8C531、8C281、8C112、8C423、8C553、8C471、8C121、8C291、8C21、8C482、8C751、8C661、8C421、8C551和8C221表现出很轻的发病症状或植株完全正常，占被检测植株的500。其余14个杂种株系的抗性水平介于两亲本之间，占被检测植株的280。华中农业大学学士学位论文（设计）12图2来源于8SCHACOENSE的体细胞杂种植株对青枯菌生理小种1菌株的抗性水平分布图FIG2DISTRIBUTIONOFBACTERIALWILTDISEASEINDICESOFSOMATICHYBRIDSOF8SCHACOENSE30DAYSAFTERTHEPLANTLETSGROWNINVITROWERECHALLENGEDWITHRACE1OFRSOLANACEARUM（株系编号（左右）为8、CHA、8C561、8C611、8C621、8C51、8C64、8C113、8C131、8C71、8C631、8C601、8C441、8C572、8C111、8C22、8C501、8C172、8C253、8C711、8C81、8C671、8C312、8C681、8C91、8C141、8C451、8C102、8C173、8C541、8C62、8C311、8C102、8C201、8C422、8C381、8C192、8C531、8C281、8C112、8C423、8C553、8C471、8C121、8C291、8C21、8C482、8C751、8C661、8C421、8C221、8C551）00204060811211121314151病情指数DISEASEINDICES34体细胞杂种植株抗病性水平的方差分析进行方差分析是为了更真实准确地反映不同抗性水平的体细胞杂种之间的抗性差异，选择组合8SCHACOENSE的50个杂种株系及其两个亲本，对其发病情况进行方差分析，被测体细胞杂种株系及其亲本的病情指数方差分析结果见表32。从表中可以看出，栽培种无性系8对青枯菌生理小种1号，生化3号菌株表现出高度感病，病情指数为1，显著高于另一融合亲本野生种SCHACOENSE的病情指数034。在被检测的50个杂种株系中，有18个株系的病情指数与栽培种无性系8亲本的病情指数相差很小，没有显著差异，同为感病植株，占被检测植株的36；有14个株系8C531、8C281、8C112、8C423、8C553、8C471、8C121、8C291、8C21、8C482、8C751、8C661、8C421和8C221表现出比野生种SCHACOENSE具有更高的抗病性，病情指数分别为010、010、010、010、009、007、006、005、003、003、003、003、001和000，显著低于SCHACOENSE的病情指数034，占被检测体细胞杂种植株的28；有15个株系表现出与野生种SCHACOENSE的抗病水平接近，病情指数与SCHACOENSE的病情指数没有显著差异，但均显著低于栽培种亲本，占被检测体细胞杂种植株的30。其余的3个株系8C81、8C671和8C312，其抗青枯病生理小种1号，生化3号菌株的抗性与野生种亲本和栽培种亲本的差异都显著，介于两融合亲本之间，占被检测植株的6。表32青枯菌生理小种1菌株接种体细胞杂种及其亲本30D后的植株发病情况TABLE32DISEASEINDICESRECORDED30DAYSAFTERROOTINOCULATIONBYRACE1STRAINOFRSOLANACEARUM基因型GENOTYPE处理1TREATMENT1处理2TREATMENT2处理3TREATMENT3处理4TREATMENT4平均病指AVERAGEOFDI差异显著性（A005）SIGNIFICANTDIFFERENCE8100100100100100A8C621100100100100100A8C611100100100100100A8C51100100100100100A8C131100100100100100A8C64100100100100100A8C113100100100100100A8C561100100100100100A8C631100100100100100A8C71100100100100100A8C601100100100100100A8C441100100100100100A8C572100100100067092AB8C111100100100067092AB8C22100100100058090AB8C501100100100047087AB8C172100100100040085AB8C253100100100031083ABC8C711100100100028082ABC8C81100100078017074BCD体细胞杂种SOMATICHYBRIDS华中农业大学学士学位论文（设计）138C671100100047036071BCD8C312047072086042062CDE8C681028069047079056DEF8C91011100028036044EFG8C141011094019033040EFGH8C451025031042042035FGHICHA037042019036034FGHI8C102014025039033028GHIJ8C173036019028025028GHIJ8C541022011039031026GHIJK8C62017019033031025GHIJKL8C311022044014017024GHIJKL8C102011025044014024GHIJKLM8C201025