第三章 基因工程常用技术ppt课件

第三章基因工程常用技术,一、质粒DNA的提取二、核酸凝胶电泳技术三、核酸分子杂交技术四、聚合酶链反应(PCR)技术五、DNA序列分析技术,质粒DNA的提取是基因工程操作中最基本的技术，最常用的是碱裂解法。,一、质粒DNA的提取,在强碱性溶液中，DNA双链的氢键断裂变性；当溶液恢复中性时，DNA双链复性。,（一）碱裂解法提取质粒DNA,1、原理,.,4,在变性后双链不分离、复性快。,共价闭合环状的质粒DNA：,.,5,线性染色体DNA：,2、碱裂解法质粒DNA提取的步骤,1）溶菌,.,7,葡萄糖：,增加溶液粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力的作用而降解（震荡）。,EDTA：,Mg2+、Ca2+螯合剂，抑制DNase活性，防止DNA被降解。,.,8,溶菌酶：,为糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分-肽聚糖中的-1,4糖苷键，具有溶菌作用。,2）变性,.,10,NaOH：,是强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。,是离子型表面活性剂，溶解细胞膜和细胞内蛋白，并结合成“蛋白质-SDS”复合物，使蛋白质（包括DNase）变性沉淀。,SDS：,.,11,3）中和,.,12,KAc：,用冰HAc把KAc溶液的pH调到4.8，以中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、蛋白质-SDS复合物沉淀。,冰HAc：,.,13,上清液中含有质粒DNA。,4）离心去除沉淀,5）纯化DNA,酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）抽提或柱层析。,.,15,酚：,比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。,防止抽提时振荡起泡。,氯仿：,异戊醇：,.,16,2倍体积的无水乙醇沉淀DNA。,6）沉淀DNA,DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。,.,17,70%乙醇洗涤DNA，干燥。,7）洗涤,8）贮存用含RNaseA(20g/ml)的TE溶解DNA，贮存于-20。,.,18,TE：,由Tris-HCl缓冲液和EDTA配制。,EDTA抑制DNase，防止DNA被酶降解。,Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸或硼酸缓冲液），利于后续操作。,RNaseA：,降解残留的RNA。,许多公司研制出商品化质粒提取试剂盒，原理大多依照碱裂解法，但在纯化步骤上采用柱层析。,.,20,3、影响质粒DNA产量的因素,质粒的产量受提取过程中各因素的影响，但最重要的是菌株的遗传背景和质粒自身的拷贝数。,一般使用endA基因突变的E.coli菌株，如DH5、JM109等。,1）受体菌株,endA基因编码核酸内切酶I，在Mg2+存在下，可将双链DNA消化为7bp的寡核苷酸片断。,.,22,常用质粒的理论产量,质粒分子大小拷贝数质粒产量（kb）（g/ml）,（二）DNA的定量和纯度测定,1、紫外光谱法,原理：基于DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰（蛋白质在280nm处有吸收峰），用微量比色杯在紫外分光光度计直接测定。,在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml。,.,26,纯DNA样品：OD260/OD280=1.8OD260/OD2302.0,OD260/OD2303BamHI2-3PstI4,保护碱基数量不合适，会影响限制酶酶切。,保护碱基,4、dNTPs,终浓度：50mol/L，4种dNTPs浓度应相等。,注意：不稳定，保存时间长会失效.,1）不同的酶需不同Mg2+：,5、Mg2+：,.,107,EDTA鳌合Mg2+；选择低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；,如扩增效率不理想，注意调整Mg2+浓度！,2）外界影响：,DNA模板、引物、dNTPs的磷酸基团均可结合Mg2+。,模板DNA0.1-2g引物各10-100pmolTaq酶2.5U4种dNTP混合物各200mol/LMg2+1.5mmol/LddH2O,标准的PCR反应体系：,100L,1、变性温度：,（二）PCR参数,94-95，一般30-45sec。,模板DNA完全变性对RCR能否成功至关重要。,可95加热3-5min预变性。,.,110,2、退火温度：,退火温度介于55-72之间，一般选择Tm-5；,选择较高的退火温度，可减少引物与模板非特异性结合，提高PCR的特异性。,.,111,3、延伸温度：,72，一般40-60sec。,72时，Taq酶处于最高的活力状态，反应速率约35-100nt/s。,延伸时间视扩增片段的长短而定，如扩增1-2kb的PCR产物，延伸1min已足够。,.,112,4、循环次数,取决于模板浓度，一般选择30次。,分析性PCR一般25-30次，制备性PCR一般30-35次，不超过40次。,循环次数太多会使非特异性产物增加。,.,113,常采用的PCR条件：,72保温10min,95预变性5min,4终止forever,五、DNA序列分析技术,目前用于测序的主要技术：,双脱氧链末端终止法化学降解法,双脱氧链末端终止法,1977年，英国剑桥大学FrederickSanger发明。,1）在单链模板、引物、4种dNTPs存在时，Klenow酶能不断地将dNTP加到引物3-OH末端，合成出与单链模板互补的新链。,基本原理：,2）Klenow酶还能以ddNTP作为底物，使之掺入正在延伸的DNA链中，但因ddNTP缺少3-OH，无法和下一个核苷酸之间形成磷酸二酯键，故在ddNTP掺入位置，链延长终止。,脱氧核苷三磷酸（dNTP）双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）,.,117,双脱氧末端终止测序法的基本操作：,A,C,G,T,ssDNA,ssDNA,ssDNA,ssDNA,Primer,Primer,Primer,Primer,Klenow,Klenow,Klenow