PCR技术原理简介ppt课件

聚合酶链式反应技术（polymerasechainreaction，PCR）,2013/3/21,1,PCR是由美国科学家KaryB.Mullis提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，获得1993年诺贝尔化学奖。,2,目录,实验流程,3,基本原理,聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）：简称PCR技术，是一种体外扩增特异性DNA片段的技术，其基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，通过变性-复性-延伸的循环操作，在体外迅速将DNA模板大量扩增。,一、基本原理,4,变性(denaturation):通过加热使DNA双螺旋氢键断裂，双链解离成单链DNA,模板,模板,基本原理,5,退火（annealing）:当温度降低时由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,基本原理,6,延伸(extension):在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸底物及Mg2+存在的条件下，53的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,TaqDNAPolymerase,基本原理,7,PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,基本原理,8,1个PCR循环完成后得到2个拷贝的靶序列,基本原理,9,n次循环后靶序列扩增的数量为2n,基本原理,10,二、PCR反应体系,PCR反应五要素：特异性寡核苷酸引物（Primer）耐热DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）DNA模板（Template）反应缓冲液（Reactionbuffer）,反应体系,11,（一）寡核苷酸引物,引物是PCR特异性反应的关键；PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,反应体系,12,引物设计的原则：,1.引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性：引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。2.产物不能形成二级结构：某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。3.引物长度一般为15-30bp左右。引物的有效长度不能大于38，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性。引物过短也会使特异性降低。,反应体系,13,引物设计的原则：引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。四种碱基分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。Tm值最好接近72：以使复性条件最佳。Tm一般低于有效启动温度510，也可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计Tm值。碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其是3端不应超过3个连续的G或C。引物自身不能有连续4个碱基互补，否则引物自身会折叠成发夹结构影响引物本身复性。,反应体系,14,引物设计的原则：8.引物之间不能有连续4个碱基互补，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带。9.引物的延伸从3端开始，3端不可修饰，而引物5端可以修饰，如加酶切位点、标记生物素、引入突变位点等。10.引物3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处,反应体系,15,反应体系,引物量：PCR反应中引物的浓度一般为0.21umol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,16,（二）耐热DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌yT1株分离提取的，TaqDNA聚合酶它的最适反应温度在75左右，在95的高温具有良好的热稳定性。在100ulPCR反应体系中。一般约需加入酶量2-4U，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸的速度。浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性，而无35外切活性，因而没有校正功能，碱基配错率为2.110-4。,反应体系,17,（三）dNTP,在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过高可加速反应速度，同时增加碱基的掺入率和实验成本，浓度过低又会降低反应速度，但可提高实验的精准性。,反应体系,18,（四）模板（靶基因，targetgene）,PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为模板用于PCR反应。但为了保证反应的特异性，一般还宜用微克水平的基因组DNA或104拷贝的扩增片段作为起始材料。,反应体系,19,（五）反应缓冲液,PCR缓冲液为反应提供所必须的合适的酸碱度和某些离子，目前最常用的缓冲液是10-50mmol/L的Tris-HCl。Tris-HCl10-25mmol/LKCl50mmol/LMgCl21.5mmol/L明胶或牛血清白蛋白100ug/mlMg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。KCl有利于引物与模板退火,反应体系,20,三、PCR实验流程,标准的PCR反应体系10扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10100pmol模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul,PCR流程,21,循环参数设置：,PCR流程,(1)变性：一般9394lmin足以使模板DNA变性。变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。若温度过低，变性不完全，会减少产量；但温度过高或反应时间过长，会导致酶活性的损失，TaqDNA聚合酶半寿期：92.52h以上，9540min，975min。(2)退火：Tm值=4（G+C）2（A+T），复性温度=Tm-（5-10）。一般为40-60，复性时间30-60s。在Tm值允许范围内，增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,22,（3）延伸：延伸温度一般选择70-75,常选72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间根据待扩增片段长度而定：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min34kb的靶序列需34min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增（4）循环次数：主要取决于模版DNA的浓度，一般为25-30次之间。循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,PCR流程,23,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,PCR流程,24,PCR完成后，取1-2ul性琼脂糖凝胶电泳检测，理想结果是目的基因扩增条带单一，片段长度与预期相符合，条带清晰。,PCR流程,25,2、在临床医学上的应用,病原体诊断：利用PCR可以检测标本中的各种病毒、细菌、真菌、支原体、螺旋体、寄生虫等病原体；标本可以是组织、细胞、血液、排泄物等。遗传病相关基因的诊断：进行产前诊断和遗传性疾病的诊断。免疫学及器官移植：分析HLA（humanleucocyteantigen