荧光定量PCR原理、应用及Stratagene_Mx3000P介绍

实时荧光定量PCR原理及应用,上海吉泰生物科技有限公司,裴杰萍,内容提纲,荧光定量PCR原理及应用StratageneMx3000P荧光定量PCR仪,常规核酸定量方法,Southern杂交Northern杂交原位杂交传统RT-PCR半定量PCR,存在的问题灵敏度准确性特异性时间,实时荧光定量PCR,定义利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控目的对起始模板进行定量优点灵敏,重复性,动态范围宽,高通量原理C(t)值与起始模板浓度的对数成反比,什么是C(t)值,C(t),Threshold（域值）,C(t)值与起始模板的关系,为什么要引入C(t)值,96replicatesofB7genemolecularbeacon,利用电泳定量,11,500counts/5200counts=2.2folddifference,实时荧光定量,Ct18andCt22,2(4Ctshift)=16folddifference,如何定量,标准曲线,未知样品的C(t)值,定量,常用的荧光试剂,SYBRGreenITMTaqMan/TaqMan-MGBMolecularBeaconsMGBEclipseTMProbesLuxprimersScorpionsTMAmplifluorQ-ZymeOthers.,dsDNADetection,Target-specificDetection,ssDNA=freedye(weakfluorophore),dsDNA=Bindsminorgroove(intensefluorophore),SYBRGreenI(双链DNA结合染料),SYBRGreenIDetection,TaqMan探针,未结合的探针,探针、引物与目的片段结合，FRET,光发射或者以热量形式散失,Donordye(Reporter),Acceptordye(Quencher),Light,Energytransfer,Taq,Taqman三通道实验,DanielCandotti-Cambridge,UK,荧光定量PCR应用,特异核酸（基因）定性、定量RNA(cDNA)基因表达差异分析基因芯片结果验证DNA病原体定性与定量GMO(遗传改良组织)检测序列特异性等位基因分型,SNP检测,应用之一：病原体检测与定量,绝对定量（特异基因的拷贝数病原体的多少）标准品（如质粒）：梯度稀释未知样品阴性对照（NTC）,应用之一：病原体检测与定量,1,4,3,2,应用之一：病原体检测与定量,应用之二：基因表达差异分析,相对定量：基因表达量上升或者表达被抑止的倍数两种样品：Calibrator（对照，如正常组织）与Sample（待测样品）两个基因：目的基因与看家基因,应用之二：基因表达差异分析,Calibrator,GeneofInterest目的基因,Ct1,应用之二：基因表达差异分析,基因表达差异2/2,Ct1,Ct2,2,Ct1-Ct2,XnX0(1+E),n,应用之二：基因表达差异分析,RNA抽提,RT,定量PCR,cDNA产物,系列稀释,两个基因的扩增效率,应用之二：基因表达差异分析,4folddown,3foldup,应用之二：基因表达差异分析,两条探针分别针对不同等位基因,A,C,G,T,A,C,G,T,应用之三：SNP分析,应用之三：SNP分析,FAM,TET,FAM,TET,应用之三：SNP分析,应用之四：GMO检测,目的：检测食品等中转基因成分的含量,大量的作物被遗传改良来获得一些性状，如：抗除草剂，抗虫，抗病等,应用之四：GMO检测抗除草剂的转基因大豆,广泛使用的除草剂的作用成分是草甘膦。草甘膦是EPSPS（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）的竞争抑制物。在草甘膦存在的条件下，EPSPS的活性被抑制。植物被转化了一种耐受草甘膦的EPSPS基因，获得抗性。,检测策略抗性EPSPS基因的量转基因大豆的量Lectin基因的量食品中大豆总量,应用之四：GMO检测,数据处理：C（t）EPSPS-C（t）LectinC（t）%GMO（1+E）,Ct,荧光定量PCR仪的硬件条件,激发光源,热循环加热、制冷,检测设备,荧光定量PCR仪应满足的要求,光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料能分开不同荧光素的激发光与发射光波长能检测的灵敏度与动态检测范围准确的温度控制和良好的孔间温度均一性.,荧光定量PCR原理及应用StratageneMx3000P荧光定量PCR仪,StratagenesNewMx3000P!,HighPerformancePersonalPrice,Stratagene公司成立于1984年,致力于发展生命科学领域的创新产品与科技.总部位于美国LaJolla,California.在欧洲与日本设有分公司.,Stratagene公司简介,Mx3000P整体设计,Mx3000P热循环系统,96孔样品槽半导体加热制冷温度均一性:+/-0.25C升降温速率:upto2.5C/sec,热循环系统,半导体加热制冷resistiveandconvectiveheatexchange独特的温度补偿条，整板温度均一性+/-0.25C热盖反应体积10-100ul,Mx3000P光路系统,PMT,96wellplate,石英卤钨灯,激发光滤镜轮,发射光滤镜轮,扫描式检测,同轴光纤,Mx3000P光学系统,石英卤钨灯(350-750nm)2个滤镜轮可选择的滤镜:Filtersets:FAM/SYBR,HEX/JOE/VIC,ROX/TexasRed,Cy5,Alexa350,TET,NED/TAMRA,Cy31PMT（光电倍增管）检测器350-700nm发射光检测范围扫描式检测设计,Mx3000P扫描系统,整板扫描3.5s滤镜轮旋转进行多通道扫描,激发光源的比较,Lasers:光强高,波长范围窄；石英卤钨灯:中等光强,波长范围宽；LED:光强低,波长受限制。,Mx3000P可用荧光染料,荧光滤镜系统,Mx3000P,四通道设计，避免光谱重叠,Mx3000P发射光滤镜轮,荧光检测系统的发展,PMT光电倍增管冷CCDCCDPhotodiodes光电二极管,荧光检测系统灵敏度比较示意图,PMT(光电倍增管),冷CCD,CCD,Photodiodes光电二极管,PMT与CCD的检测原理,hv,e-,e-,PMT,CCD,CCD与PMT检测区别,无边缘效应,边缘效应,CCD,Mirror,SimultaneousIllumination/Detection,CCD与PMT检测结果均一性对比,Ctvs.Wellnumber(acrossplategroupings),Mx3000P均一性实验,96welluniformityrun.SYBRGreenIdetection,96wellsMeanCt=18.1St.Dev.=0.05C.V.=0.3%CtRange=0.26cycles,2-foldserialdilution(20,000to1.2copieshgDNA.-ActinMol.Beacon),Std.CurveR2=0.996Slope=-3.183AmplificationEfficiency=106.1%,Mx3000P的分辨率与灵敏度检测图。,10 xdynamicrange,T7hydrolysisprobe,8replicateseachconcentration,10 xdynamicrangestandardcurve,Ctrange6-39,Rsq=0.999,Efficiency=98.6%,Mx3000P检测动态范围检测图（高达十个数量级）。,Mx3000PMultiplex-4ColorResult,FAM,FAMHEX,Mx3000PMultiplex-4ColorResult,FAMHEXROX,Mx3000P4通道实验结果,FAMHEXROXCy5,Mx3000PMultiplex-4ColorResult,Mx3000P4通道标准曲线,利用FullVelocity技术提高PCR运行速度,最新的工程聚合酶Archaeal(non-Taq)DNApolymerase同样具有优越的:灵敏度特异性可重复性,FullVelocity(40cycles),TIMESAVED!,传统PCR(40cycles),Mx3000P软件,易学易用各种数据分析方式：自动分析或者手动分析支持荧光定量PCR的多种应用模式,多种应用模式,软件的结构,PCR板的设定,PCR程序设定,运行时的状态,实时扩增数据,软件自行优化的数据分析,标准曲线,相对定量ResultsDisplay,4folddown,3foldup,基因分型结果显示,Userdefinedgenotypes,colorcodedpopulations,andautomaticcallingontextreport,“只读板”实验结果,结果文本显示,TextReportorrawdatacanbeexportedtoExceloratextfile,Customizereport,多种格式输出结果,TextReport,PowerPointpresentation,Anyscreenshot,BrilliantQRT-PCRandQPCRReagents,MastermixesandreagentkitsforanyfluorescentchemistryCompatiblewithsequence-specificprobesSYBRGreenkits,DNAAmplification,BrilliantSYBRGreenQPCRMasterMixBrilliantSYBRGreenQPCRCoreReagentKit,RNAAmplification,BrilliantSYBRGreenQPCRMasterMix,1-Step,BrilliantSYBRGreenQPCRReagents,DNAAmplification,BrilliantQPCRCoreReagentKitBrilliantPlusCoreReagentKitBrilliantQPCRMasterMix,2-stepRT-PCR,RNAAmplification,BrilliantQRT-PCRCoreReagentKit,1-StepBrilliantQRT-PCRMasterMixKit,1-StepBrilliantQRT-PCRPlusCoreReagentKit,1-Step,1-stepRT-PCR,BrilliantQRT-PCRCoreReagentKit,2-StepBrilliantQRT-PCRPlusCoreReagentKit,2-Step,BrilliantProbe-basedQPCRReagents,2-folddiscriminationusingtheBrilliantSYBRQPCRmastermixontheMx3000PinstrumentCtvariation0.5Cts,10,000copies,5,000copies,BrilliantQPCRKits,Target=Betaactin/Template=HumangenomicDNA36wellsof10,000copieswithaCtvariationof0.5Ctsand36wellsof5,000copieswithCtvariationof0.5Cts,引物探针设计软件,设计SYBRGreen引物,TaqMan探针,FRET探针和Molecularbeacons（分子信标）,快速,简单,功能强大,独特优点能高效设计双标记探针(Taqman,FRET探针,分子信标等)优化的引物设计能适应不同的荧光定量PCR方法能进行等位基因分析与多重定量PCR探针设计有二级结构分析功能,能图形化显示各种位置与结构内置BLAST连接,BeaconDesigner4.0工作界面,FastTrackQPCR培训项目,优势：快速有效的QPCR培训；更高层次的QPCR应用培训；能满足客户的不同要求；从入门到高级的完全覆盖；用户能直接咨询Stratagene的QPCR应用专家,FastTrack培训内容,Web-seminar（网络讲座）IntroductiontoQPCRGuide（QPCR入门向导）RegionalQPCRUserGroupMeetings（区域内用户会议）FAS（FieldApplicationScientist）会