（医学PPT课件）流式细胞术在白血病MICM分型诊断中的作用(压缩图片)

流式细胞术在白血病MICM分型诊断中的作用,1,M：morphology,形态学I：immunology,免疫学C：cytogenetics,细胞遗传学M：molecularbiology,分子生物学（moleculargenetics，分子遗传学）,2,M：morphology,形态学（FAB分型）,髓系（acutenonlymphocyticleukemia,ANLL;acutemyeloidleukemia,AML）（M0：急性髓细胞白血病微分化型）M1：急性原粒细胞白血病未分化型M2：急性原粒细胞白血病部分分化型M3：急性早幼粒细胞白血病M4：急性粒-单核细胞白血病M5：急性单核细胞白血病M6：急性红白血病M7：急性巨核细胞白血病,淋系（acutelymphocyticleukemia,ALL）L1：原幼淋巴细胞以小细胞为主L2：原幼淋巴细胞以大细胞为主L3：大细胞为主，细胞质多，深蓝，蜂窝状,3,I：immunology,免疫学,分化簇（clusterofdifferentiation，CD），CD1CD350,4,I：immunology,免疫学,5,6,7,C：cytogenetics，细胞遗传学,染色体核型分析（chromosomekaryotyping）,8,C：cytogenetics，（continued）,荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH），介于分子生物学与细胞遗传学之间的分子细胞遗传学,9,M：molecularbiology，分子生物学moleculargenetics，分子遗传学,基因突变（genemutations）融合基因（fusiongenes）BCR-ABLTEL-AML1,10,流式细胞术,FlowCytometry，FCM,11,国内临床常用3种流式分析仪,BCCytomicsFC500,BCEpicsXL,BDFACSCalibur,Skipothers,12,高端流式细胞仪,FACSCantoII1：全数字化2：临床型3：3个激光4：8色荧光5：全自动开关机,LSRII1：科学研究型2：262144通道数3：4个激光4：10色荧光5：UV激光,13,高端流式细胞仪（续）,FACSAriaII1：高速分选2：分选精度1/32滴3：3个激光4：13色荧光5：仪器随开随用,Influx分选仪1：模块化设计2：200000/秒(分析)50000/秒(分选)3：5个激光4：24色荧光5：无菌环境,back,14,FCM原理（动画）,15,FACSCalibur光路图,16,流式细胞术的简单步骤,标本：外周血、骨髓、体液（脑脊液、胸水、腹水）、组织（淋巴结、肝、脾）,标本保存：抗凝血，室温（15-25）；放置时间超过24小时，最好使用肝素抗凝，4（标记染色前半小时复温至室温）。,标本处理：无需特殊处理。全血标记不推荐使用淋巴细胞分离液。,抗凝剂选择：血液：EDTA（超过24小时不稳定）、ACD（细胞72小时内稳定）、肝素（72小时内稳定）骨髓：肝素,一、标本准备,17,流式细胞术的简单步骤（续）,全血标本：血细胞计数仪计数绝对计数管（昂贵）,细胞浓度：按说明书比例操作。残存白血病检测需要加大样本比例。,二、细胞计数,18,流式细胞术的简单步骤（续）,表面抗原：1.荧光素（FITC、PE、PerCP、APC等）标记的单克隆抗体试剂中，加入适量标本混匀，室温避光孵育15分钟；2.加入溶血素，混匀，室温避光10分钟；3.用PBS洗涤（300g，离心5分钟）；4.（不能及时检测时）加多聚甲醛，4保存。,三、免疫荧光染色,细胞内抗原：1.膜表面抗原染色（同前）；2.透膜：使用透膜剂，室温15分钟；300g，离心5分钟；3.用相应荧光标记的单克隆抗体标记胞（核）内抗原，室温避光孵育30分钟；4.洗涤；5.（不能及时检测时）加多聚甲醛，4保存。,19,流式细胞术的简单步骤（续）,四、上机检测,五、质量控制,单细胞悬液制备质量控制：适当的制备方式溶血处理组织标本处理温度与pH,免疫荧光染色的质量控制：温度pH荧光染料的浓度固定剂,设置对照：阳性对照、阴性对照、正常对照,20,荧光素的特性及应用,21,22,数据分析和报告,一、数据分析,常用数据显示方式：,23,检测信号及意义：,散射光信号前向散射光（forwardscatter，FSC）：细胞大小,24,检测信号及意义：,散射光信号侧向散射光（sidescatter，SSC）：胞内颗粒多少,25,检测信号及意义：,FSC/SSC二维点图（dotplot）,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,阈值,细胞碎片,26,检测信号及意义：,荧光信号根据荧光素交联的单克隆抗体不同而表达不同的意义,27,（一）设门（gating）,28,29,30,（二）荧光强度,（三）单参数分析,（四）多参数分析,31,二、数据解释及报告,1.定性的描述（阳性或阴性）2.评估抗原表达强度3.区分弱阳性和阴性群体,运用流式分析造血细胞的抗原表达情况，远远多于对形态学结果的简单证实，能够提供大量的信息，可能帮助形态学确认某些诊断，也可能提出之前没有考虑的诊断；在一些典型表现下，流式免疫分型可以在其他方法的辅助之下诊断疾病。但是，流式免疫分型结果的解释应与临床、形态学、细胞遗传学等其他方法结合使用，综合考虑，做出疾病的诊断与分类。,32,正常血细胞发育过程的抗原表达规律,按WHO造血和淋巴组织肿瘤分类（2008年版）,33,34,35,36,37,38,WoodB,etc（2007）,39,急性白血病的免疫表型,40,41,42,43,44,45,46,47,急性髓细胞白血病的免疫表型,48,49,刘艳荣，等（2010）,50,51,52,急性淋巴细胞白血病的免疫表型,53,54,急性系列不明型白血病的免疫表型,55,56,57,慢性淋巴细胞白血病的免疫表型,58,一、CLL的免疫表型特点,59,二、FCM检测CLL的预后指标,ZAP-70ZAP-70+CLL预后不好。CD38是CLL疾病侵袭的重要标志，CD38+B-CLL患者预后不好。,60,三、鉴别单克隆B淋巴细胞增多症,单克隆B淋巴细胞增多症（MBL）指健康个体外周血中存在低水平的单克隆性B淋巴细胞增多。,61,四、鉴别诊断,CLL是以外周血及骨髓中成熟的淋巴细胞增多为主要临床特点的恶性疾病。除了CLL，还包括其他多种生物学上完全不同的成熟B淋巴细胞肿瘤。正确鉴别将有助于预后评估和治疗方案的选择。,62,63,64,65,66,67,免疫分型的抗体组合原则,68,一、常用抗体,白细胞分化抗原（leukocytedifferentiationantigen）是指血细胞在分化成熟为不同谱系、不同阶段及细胞活化过程中，出现或消失的细胞表面标记分子。1982年，国际统一使用分化群（clusterofdifferentiation，CD）作为白细胞分化抗原和相应单克隆抗体的命名，CD分子在流式细胞术的血液学应用中发挥着重要作用。CD1a表达于皮质胸腺细胞、树突状细胞和Langerhans细胞，主要用于T淋巴细胞白血病及淋巴瘤的免疫分型。表达CD1a的T-ALL为皮质型。CD2泛T细胞标志，表达于T淋巴细胞、胸腺细胞和大多数NK细胞上。急性T淋巴细胞白血病（acuteTlymphoblasticleukemia，T-ALL）、成熟T细胞增生异常性疾病、急性双表型白血病、原始NK细胞淋巴瘤/白血病、肥大细胞白血病及少部分急性髓细胞白血病（acutemyeloidleukemia，AML），尤其是变异性急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocyticleukemia，APL）中有CD2表达。CD3表达于T淋巴细胞、胸腺细胞和NK细胞。是T细胞增值性疾病中最特异的标志，在成熟和部分初始T细胞中均有表达。胞浆CD3（cCD3）在初始T细胞（前胸腺细胞）上表达，胸腺细胞表达胞浆和（或）膜表面CD3（mCD3）。前体T细胞肿瘤通常不表达mCD3，但cCD3为阳性。,免疫分型的抗体组合原则,69,CD4表达于辅助性T淋巴细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。大多数外周血T细胞淋巴瘤、部分AML、慢性粒单核细胞白血病（acutemyelomonocyticleukemia，CMML）、急性单核细胞白血病（AML-M4/M5）、APL和组织细胞肿瘤中伴有CD4表达。少部分T-ALL中有CD4限制性表达，大多数T-ALL同时表达CD4、CD8或者两者同时为阴性。CD5主要表达于胸腺细胞、成熟T淋巴细胞和B淋巴细胞亚型。作为一个泛T细胞抗原，CD5可表达于成熟或不成熟T细胞增值性疾病中，包括T-ALL。在肿瘤性T细胞发育过程中，CD5容易丢失。正常人外周血和淋巴组织中存在CD5+B细胞，儿童及年轻患者更多见。CD5主要表达于慢性淋巴细胞白血病（B-cellchroniclymphocyticleukemia，B-CLL）、小淋巴细胞淋巴瘤（smallcelllymphocytelymphoma，SLL）和套细胞淋巴瘤（mantlecelllymphoma，MCL）。少部分弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL）表达CD5，而且原发性CD5+DLBCL预后较CD5-DLBCL更差。CD7主要表达于T淋巴细胞、NK细胞和多能干细胞。在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达于整个T细胞分化发育过程中。在外周T细胞异常性疾病中，CD7通常表达异常、减弱或消失。T-ALL中CD7阴性表达者仅占2%。此外，CD7还可表达于原始NK细胞淋巴瘤/白血病和AML，而APL和B系淋巴增值性疾病中，CD7表达多为阴性。,免疫分型的抗体组合原则,70,CD8表达于杀伤性或抑制性T淋巴细胞、胸腺细胞和某些NK细胞上。大部分大颗粒T淋巴细胞白血病（T-largegranularlymphocyteleukemia，T-LGL）和肠型淋巴瘤、少部分外周T细胞增值性疾病表达CD8。极少T-ALL表达CD8，而CD4阴性。CD9表达于单核细胞、前B细胞亚群、激活的T细胞、嗜酸与嗜碱性粒细胞、血小板，主要用于急性白血病免疫分型及微量残留病的检测。CD10又名急性淋巴细胞白血病共同抗原（commonacutelymphoblasticleukemiaantigen，CALLA），表达于前B、前T淋巴细胞、生发中心B细胞和成熟粒细胞绝大多数急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）、少数T-ALL、多数滤泡性淋巴瘤（follicularlymphoma，FL）、部分DLBCL和Burkitt淋巴瘤、少数AML-M5中有CD10表达。成熟粒细胞缺乏CD10的表达常常与骨髓增生异常综合征（myelodysplasia，MDS）相关。在FL和DLBCL中，CD10+者预后更好。CD11b表达在单核细胞、粒细胞和部分NK细胞上，成熟B和T细胞不表达。部分急性髓细胞白血病表达CD11b，常代表单核细胞的分化，AML-M0、M1和M2很少表达。APL通常也是CD11b阴性。常用CD11b观察MDS中单核和粒细胞的发育分化。CD11c单核细胞和组织巨噬细胞中强表达，粒细胞中表达强度较低，正常激活的CD8+细胞也可表达。CD11c强表达式毛细胞白血病（hairycellleukemia，HCL）和AML-M5的典型特征。其他恶性血液病，包括B-CLL，边缘带B细胞淋巴瘤（marginalzoneB-celllymphoma，MZL）、除APL外的其他AML也有CD11c的弱表达。,免疫分型的抗体组合原则,71,CD13表达于粒细胞、单核细胞及其前体细胞上。CD13数全粒细胞分子，不同发育阶段的所有粒系细胞均有表达。大多数AML和5%15%ALL可表达CD13。CD14是成熟单核细胞的最好标志，大多数CMML和AML-M4中的单核细胞强表达CD14；AML-M5中，原单和幼单细胞通常为CD14阴性或弱表达。正常粒细胞CD14阴性，但慢性增值性疾病，如CML或真性红细胞增多症（polycythemiavera，PV）中的粒细胞部分有CD14的表达上调。CD15除原粒细胞外的所有粒细胞、多数单核细胞、少数巨核细胞和组织细胞表达CD15。CML、部分AML和大多数经典型霍奇金淋巴瘤（Hodgkinlymphoma，HL）表达CD15。CD16表达于正常的粒细胞、NK细胞和大颗粒T细胞上。T-LGL、NK细胞增生、肝脾T细胞淋巴瘤和部分单核系肿瘤中常表达CD16，而原粒细胞和典型APL细胞中CD16阴性。粒细胞发育异常时常可见CD16表达下调。CD19表达于B系细胞核滤泡状树突细胞上，成熟和不成熟B系肿瘤中均表达CD19，良性浆细胞、少数恶性浆细胞也可见CD19的表达，部分AML表达CD19，常与t（8；21）相关。,免疫分型的抗体组合原则,72,CD20表达前B细胞晚期和成熟B细胞上，但前体细胞和终末浆细胞不表达。CD20出现在免疫球蛋白（Ig）轻链基因重排和表面Ig表达之间的B细胞表面。多发性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）表达CD20者预后不好。CD22为泛B细胞标志，其表达与CD22抗体所标记的荧光素有直接关系。利用CD22-PE抗体，可以发现CD22表达于B细胞分化的早期，在成熟期表达强度增加。而利用CD22-FITC抗体，只能发现在成熟的B细胞表面CD22阳性，此时表面CD22可与表面IgM和（或）IgD同时或提前表达。绝大多数TdT+前体B细胞呈胞浆CD22阳性；多数淋巴细胞恶性肿瘤、特别是HCL、脾MZL和幼淋巴细胞白血病（prolymphocyticleukemia，PLL）强表达CD22，而B-CLL中CD22表达较弱。CD23表达在正常成熟B细胞上，大多数B-CLL/SLL强表达。CD5+CD23+是B-CLL/SLL的典型特征，而MCL为CD5+CD23-，少部分MCL表达CD23，但表达较弱。部分FL和DLBCL、少数AML-M5和CMML中表达CD23.CD25表达于激活的T、B细胞，主要表达于HCL、成人T细胞白血病/淋巴瘤（adultT-cellleukemia/lymphoma，ATCL）和少数其他T、B细胞增殖异常的疾病中。变异性HCL不表达CD25，对经典的HCL治疗不敏感，生存期短。CD30主要表达于激活的T、B淋巴细胞和单核细胞。经典型HL和间变大细胞淋巴瘤（anaplasiclargecelllymphoma，ALCL）可伴有CD30强表达，部分B系淋巴瘤又有CD30的表达。HL患者胞浆CD30水平增高时预后不良标志。,免疫分型的抗体组合原则,73,CD33表达髓系前体细胞、粒细胞和单核细胞，正常人的CD33的表达强度有变异。各AML亚型均有CD33的表达，10%20%的ALL也可伴CD33表达。CD34表达于早期造血干/祖细胞，是髓系早期细胞和TdT+不成熟淋巴细胞的表面标志。大多数ALM和前体B/T淋巴细胞白血病表达CD34，粗颗粒型APL通常不表达，而细颗粒型APL往往伴有CD34部分表达。CD36表达于单核细胞、红细胞、巨核细胞和血小板，与CD64联合分析单核细胞的分化比CD14更敏感。CD38表达于前体B细胞、终末分化的浆细胞、髓系祖细胞、粒细胞和单核细胞和红系前体细胞。成熟B细胞CD38的表达减弱或消失。除浆细胞中强表达CD38外，绝大多数AML和B-ALL表达CD38，强度较浆细胞弱。CD38+B-CLL患者预后不好。CD41a和CD42b表达与巨核细胞和血小板，常用于AML-M7的免疫分型诊断，但有时会出现于其他细胞，例如单核细胞的非特异性结合。CD45有名白细胞共同抗原（leukocytecommonantigen，LCA），表达于所有造血细胞（不包括成熟红细胞和血小板）及造血细胞的个分化亚群上。在白细胞成熟过程中，CD45的表达有区别，原始细胞表达较低，成熟髓细胞中度表达，单核细胞和淋巴细胞表达最高。CD45阴性表达的常见肿瘤包括：MM、M6，部分B-ALL和髓外肿瘤。成熟B细胞肿瘤可能伴有CD45表达减弱。有些MM弱表达CD45，与骨髓瘤细胞的增殖率有关。,免疫分型的抗体组合原则,74,CD45RA和CD45RO表达于B和T细胞亚群，前者主要表达在初始细胞，后者大部分表达在记忆性T细胞上。CD52表达于所有正常T细胞、多数恶性T细胞和成熟B细胞增值性疾病中。目前免疫分型检测的主要目的是用于抗CD52的单抗治疗。CD56表达NK细胞、部分T细胞和单核细胞，少数增生期的髓细胞也可弱表达。NK细胞白血病、部分MM、AML中常伴CD56的阳性表达。CD19和CD56共表达与伴有t（8；21）的AML相关。在伴有t（8；21）或t（15；17）的AML中，CD56的阳性表达是预后不好的因素。CD58表达于所有造血和非造血细胞，前体细胞表达较强，成熟细胞表达强度减弱。CD58主要用于区分ALL和良性前体B细胞，可用于ALL和MRD检测。CD61表达与巨核细胞和血小板，常用于AML-M7的免疫分型诊断，但有时会出现于其他细胞，例如单核细胞的非特异性结合。与CD42b联合应用可以区分血小板和原始细胞。CD64表达于单核细胞和中性粒细胞上，主要用于分析单核细胞的分化。CD64可表达于AML-M4/M5和CMML中的单核细胞，大多数其他类型AML中的原始细胞也表达CD64，但较单核细胞表达弱。,免疫分型的抗体组合原则,75,CD71一种转铁蛋白受体，通常在增殖活跃的造血细胞上表达，红系前体细胞表达较强，和可以表达与髓系、激活的淋巴增殖细胞上。可鉴别不成熟的红细胞，主要用于M6和MDS的诊断。CD103表达于B淋巴细胞亚群和粘膜固有层T淋巴细胞，在HCL中强表达。肠型T细胞淋巴瘤和MZL也可表达CD103。CD117表达于造血祖细胞、不成熟的粒细胞和肥大细胞。大多数AML中的原始细胞均有CD117表达，多数M5可见CD117阴性。另外，肥大细胞增生、MM、部分T-ALL和少数CD8+成熟T淋巴细胞增殖性鉴别均可见CD117阳性表达。CD123表达于骨髓干/祖细胞、单核细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨核细胞。浆样树突状细胞和嗜碱性粒细胞中强表达。多数AML和B-ALL常伴有CD123高表达。CD138主要表达于浆细胞，用于MM的免疫分型和残留骨髓瘤细胞的检测。CD200表达于胸腺细胞、B细胞、脾滤泡树突状细胞和部分T细胞亚群上。有助于鉴别CLL和MCL，CLL常为CD200+，而MCL往往为CD200-。CD235a又名GlyA表达于人红细胞、红系前体细胞上，主要用于识别红细胞。,免疫分型的抗体组合原则,76,Bcl-2表达于T细胞和部分B细胞上，正常生发中心细胞Bcl-2的表达为阴性。主要用于鉴别CD10+的FL和Burkitt淋巴瘤，FL常表达Bcl-2，而Burkitt淋巴瘤为Bcl-2的表达为阴性。cIgM（c）前B细胞表达的第一个免疫球蛋白重链，表达于部分浆细胞和成熟B细胞。常用于判断B-ALL的分期。cyclinD1细胞周期蛋白，多种肿瘤中高表达，可作为评价预后的指标，造血系统肿瘤中主要应用于CML的诊断。FMC7表达于成熟B淋巴细胞亚群，主要用于鉴别B-CLL和其他B系增殖性肿瘤，B-CLL中FMC7表达为阴性。HLA-DR表达于各阶段的B淋巴细胞（大部分浆细胞除外）、造血祖细胞、髓系、红系和巨核系前体细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、不成熟的T细胞及活化T细胞上。原始粒细胞表达HLD-DR，细胞成熟至早幼粒细胞时HLA-DR消失。绝大多数B-ALL和AML表达HLD-DR，但APL、MM和大部分T细胞白血病/淋巴瘤一般不表达。Ig和Ig表达于正常B淋巴细胞，B系淋巴瘤中常见胞膜免疫球蛋白轻链的限制性表达，MM中常见胞浆免疫球蛋白轻链的限制性表达。,免疫分型的抗体组合原则,77,MPO髓过氧化物酶，表达于粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，在循环单核细胞中低密度存在。某些AML的原始细胞也有表达，MPO用于髓系白血病及髓系分化的鉴别。TCRTCR分子是有/或/链组成的异二聚体，可与CD3复合物同时表达。多数胸腺细胞和成熟T细胞表达TCR/异二聚体，不足5%的胸腺细胞和成熟T细胞表达TCR/。主要用于成熟T淋巴系统肿瘤的分类。TdT末端脱氧核酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase，TdT）存在于正常胸腺和骨髓中未成熟T、B细胞的胞核中。大多数T-ALL和B-ALL、部分AML（AML-M0更多见）和少数淋巴瘤表达TdT。TCRVT细胞受体的链变异区，用于鉴别T细胞的克隆性，主要应用于成熟T细胞增殖性肿瘤的免疫分型诊断中。ZAP-70表达于T细胞、NK细胞核前B细胞上，主要用于CLL/SLL的免疫分型。细胞内ZAP-70的表达与IgVH基因突变状态有关，ZAP-70+CLL预后不好。,免疫分型的抗体组合原则,78,免疫分型的抗体组合原则,二、白血病免疫分型抗体组合原则,（一）国际指南中抗体使用原则,国际“临床和实验室标准化协会”血液淋巴系统肿瘤细胞的临床流式分析指南（第二版，2007）指出：免疫分型的一个基本原则是肿瘤性血液淋巴细胞表达正常细胞特定系列和特定成熟期的表面和细胞内抗原，这些抗原可被适当的抗体检测。较理想的组合是，实际的数量足够识别异常细胞和标本中存在的所有正常细胞。当对一个已经诊断的病例检测以证实、分类、监测及分期时可使用较少的抗体。在设计组合是有两种方法：一步法，使用足够的试剂一次性完成恶性细胞和正常细胞的定性；两步法，开始使用较少的抗体，然后根据第一步的结果选择其他的抗体。总体来讲，使用试剂越多，对异常细胞的检测和定性的敏感性和特异性越高。基于有用的临床和形态信息，可采用“靶点”方法选用少数抗体。虽然这种方法可以减少成本，但万一提供的临床信息是错误的或缺乏的，则具有一定的风险。根据国际上的一致意见，需要大量的试剂来完成慢性淋巴增殖性疾病、组织淋巴瘤、急性白血病和其他血液学肿瘤的免疫分型。指南参与者认为，至少需要20个抗体来完成急性白血病的定性，对慢性淋巴细胞增殖性疾病需要相似的抗体数。另外，定的表面和细胞内抗体最近被证明具有诊断和预后意义。随着临床有关新抗体的认识，原本较大的分类抗体数开可能要增加。,79,免疫分型的抗体组合原则,（二）国际流式细胞专家的共识,2006年，国际流式专家在Bethesda对诊断血液淋巴系统肿瘤所需要的试剂进行了讨论达成一定共识。,80,免疫分型的抗体组合原则,（三）国内流式细胞专家使用原则（北京大学血液病研究所）,急性白血病亚型分型和MRD检测时使用的主要抗体：急性白血病的诊断和分型抗体B-ALL：CD19、CD10、CD34、TdT、CD20、CD22、CD79a、skapp