基因在人胃癌组织和细胞株中的表达及其意义硕士学位论文.doc

硕士学位论文 中文摘要摘要: 目的：本实验采用实时荧光定量PCR、Western Blot法以及免疫组化SP法分别检测fascin1在胃癌细胞及胃癌组织中的表达，进一步分析fascin1的表达水平和胃癌患者临床病理参数的相关性，旨在探讨其与胃癌发生、发展及预后的关系，为胃癌的基因治疗提供参考数据。 方法：本实验由两部分组成：将正常胃粘膜上皮细胞株GES-1，不同分化胃癌细胞株MKN28、SGC-7901、MKN45分别种到25cm培养瓶，待细胞长到80%-90%融合时，选择生长状态良好的细胞进行RNA和蛋白质的提取后，采用RT-qPCR检测以上四种细胞fascin1 mRNA的表达水平;Western Blot法检测以上四种细胞中fascin1蛋白的表达水平。采用免疫组化SP法检测fascin1在80例胃癌组织标本中的表达水平，同时取距离肿瘤组织5cm的癌旁正常胃粘膜20例作为正常对照，并结合患者的临床病理参数统计分析这些参数与fascin1之间可能的关系。 结果：（1）实验中提取的细胞RNA和蛋白质经过质量测定，均符合实验要求。（2）实时荧光定量PCR和Western blot分析法结果显示：正常胃粘膜细胞及不同分化胃癌细胞株均有fascin1mRNA和fascin1蛋白的表达；三组胃癌细胞的fascin1mRNA和fascin1蛋白的相对表达量较正常胃粘膜细胞分别具有差异性，且差异具有统计学意义（P5cm标本中fascin1的表达高于直径5cm者（P0.05），在胃癌伴远处转移的病例fascin1的表达率相对较高，且fascin1的表达水平与胃癌的TNM分期相关，胃癌患者的TNM分期越晚，fascin1表达越高（P0.05），fascin1的表达仅与胃癌组织的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移远处转移和TNM分期有关，而与肿瘤位置、年龄、性别没有显著相关性。结论：本研究发现fascin1的表达与胃癌的分化程度、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关，与患者年龄、性别没有相关性。以上结论说明fascin1在胃癌浸润和恶性转移中可能起一定的病理作用，为胃癌的基因治疗提供参考数据，针对fascin1的靶向治疗可能使化疗耐药、fascin1阳性患者好得较好的疗效。硕士学位论文 符号说明硕士学位论文 目录符号说明英文缩写 英文全称中文名称cDNAcomplementary DNA互补脱氧核糖核酸mRNAmessenger RNA信使RNAmiRNAmicroRNA微小RNAfascin-1fascin actin-bundling protein 1肌成束蛋白1DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸RNAribonucleic acid核糖核酸RT-qPCRReal-time Quantitative PCR 实时荧光定量PCRRTreverse transeription逆转录SPSSStatistical Package for Social Statistics社会科学统计软件包EPEppendorf tubeEppendorf 离心管RTreverse transeription逆转录PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应DEPCdiethyl pyrocarbonate二乙基焦磷酸盐SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis聚丙酰胺凝胶电泳SDSsodium dodecylsulphate十二烷基磺酸钠DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺DMSOdimethyl sulfoxide二甲亚砜PBSphosphate buffer磷酸盐缓冲液DTTdithiothreitol二硫苏糖醇HRPhorse radish peroxidase辣根过氧化物酶EMSAelectrophoretic mobility shift assay凝胶迁移率分析硕士学位论文 前言第一章 前 言胃癌(gastric cancer)是严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，发病率在世界范围内占恶性肿瘤的第二位，是目前我国病死率较高的恶性肿瘤之一，不同地区发病率有所不同，不同国家与地区胃癌的发病率与死亡率亦有明显区别，高低之比可相差10倍；以日本为首的日本、智利、冰岛等国均为高发地区；而印度、印尼、马来西亚等国的发病率较低1-2。我国胃癌发病率也高，尤其是江浙沿海一带、甘肃河西、胶东半岛。胃癌是多种病因系统作用的结果,幽门螺杆菌（ Helicobacter pylori，Hp）几乎是所有胃癌患者的患病原因是被国内外公认的，但在胃癌进展的复杂的进程中的其具体作用机制，目前仍不清楚。最近，Guilford 等学者研究发现E-Cadherin基因突变会导致得家族性癌症综合征的病人在其一生中患胃癌的概率高达70%，该基因突变一旦被确认，该项预测性检测指标基本上可以预示患病危险度高的家族成员发展为弥漫型胃癌的危险度3，也是第一次在分子水平确定其在癌症中的作用。世界癌症研究基金会和美国癌症研究所在他们关于饮食和锻炼的大规模科学研究报道中提出，胃癌可以通过适当的饮食及适量的体育锻炼去预防。吸烟与胃癌的关系已经被确认，欧洲前瞻性癌症和营养调查计划发现了吸烟和患胃癌风险呈明显正相关。研究已经证实了人类EBV病毒是一种DNA病毒，人被EBV病毒感染后可引起鼻咽癌(NPC) 、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤等疾病，很大可能是EBV可以通过唾液或食物吞咽下行到胃部；首先，EBV病毒能直接感染部分胃黏膜；其次，胃粘膜发生损伤后，该部位容易导致淋巴细胞聚集，因此，EB病毒容易首先感染淋巴细胞，再进入到淋巴系统4。NF-kappaB是真核细胞的转录因子，近年来大量研究发现其与胃癌的发生、发展和恶性转移有密切关系，并在肿瘤化疗药物抵抗中发挥重要的作用，胃癌可能接受NF-B 的调控，且在胃癌发生和进展过程中可能发挥下游基因的作用5。Folkman等人通过研究证实血管新生对肿瘤的生长、浸润有重要意义，他认为癌细胞产生了某种物质，从而导致新血管形成，而新血管能给肿瘤提供进一步生长必不可少的营养6。血管内皮生长因子（VEGF-A）、 血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1 )和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)结合在血管生成中起关键作用，而VEGF-C、VEGF-D与VEGFR-2、VEGFR-3结合在淋巴管生成中起关键作用。胃癌血管及淋巴管新生对胃癌的浸润和复发至关重要，VEGF-A在胃癌组织中表达水平增高，并在胃癌血管新生过程中起关键的作用；在胃癌组织中VEGF-C、VEGF-D呈现过表达，在胃癌淋巴管新生过程中起举足轻重的作用；VEGF-A、VEGF-C及VEGF-D的表达水平随着胃癌呈现血管及淋巴管转移而增高7-9。 目前，胃癌的首选治疗方法首选手术切除，然而，胃癌的恶性转移和高复发率使得人们着力寻找更加有效的对策而努力。手术加术后化疗是治疗的有效保证，然而，耐药是肿瘤化疗失败的一个最主要的原因，为了克服这一障碍，有学者将针对多药耐药（MDR1）的小分子RNA转染到胃癌细胞 ，能有效地抑制了MDR1 mRNA 和蛋白的表达水平，使得该细胞对抗肿瘤药物柔红霉素的耐药性大大降低10。同时，人类在寻找血清学标记物方面做了大量的努力，在过去几年里，综合分子病理学研究，明确了有关胃癌发展和进程某些异常的细节，但他们的诊断功效有待进一步去研究证实。肿瘤抗原，无论是血清(CEA,CA19-9,CA125, CA50)还是胃液的(CEA, CA19-9)均未找到一种灵敏度高、特异性高的指标。临床上对患者血的CEA和CA19-9检测，可以提高胃癌检出率将近30-40%，但以上检测指标一般都到胃癌晚期才会升高，对诊断早期胃癌临床意义仍不大。胃镜是目前临床上检查胃肠腔内疾病最有效的手段，无论是局限性还是弥散性，良性抑或是恶性。近年来，由于对胃癌发生发展分子通路的深入见解，临床上，靶向治疗方法在已成功应用于胃癌患者的治疗和预后判断；如HER2通路(Cerb-B2)靶向：曲妥珠单抗，是抗Her 2的单克隆抗体,已成功应用于临床，它能特异性的针对HER2阳性的肿瘤细胞，干扰蛋白质的表达，从而杀死肿瘤细胞11。国际抗癌联合会及日本胃癌规约均认为胃癌的浸润深度和淋巴结转移程度是评价胃癌预后的独立且重要因素，因此，深入研究胃癌浸润或转移的相关分子机制，建立控制胃癌浸润和恶性转移的有效方法，对于胃癌的治疗及预后有着十分重要的临床意义，已成为胃癌研究的前沿和热点之一。肌成束蛋白(fascin actin-bundling protein 1，fascin1),又名成束蛋白基因,于1994年从畸胎瘤中克隆，该基因定位于染色体7q22，其蛋白质编码产物最初由Yamashiro 等人从宫颈癌Hela细胞中提纯出来的，是一种进化保守的、相对分子质量为55kD的细胞内蛋白,位于迁移细胞前缘的突起和伪足中肌动蛋白束的中心，是组成细胞骨架的主要成分，其N端11-50的氨基酸残基系列高度保守，第39位的丝氨酸为蛋白激酶C(PKC),FDG的磷酸化位点，该位点的磷酸化可调节fascin 1蛋白与F-肌动蛋白的结合活性,从而参与细胞骨架的构成,能调节细胞膜表面丝状伪足、片状伪足和微棘的形成，从而增加细胞的运动能力12、13、14，以上作用提示其可能在肿瘤的发展和浸润中具有重要的作用。此后fascin1与细胞运动相关的研究相继见于报端。 近来，国内外很多研究报道fascin1在许多上皮性肿瘤中异常表达。fascin硕士学位论文 前言在正常乳腺组织不表达，人类乳腺癌细胞株MDA-MB-435中的fascin 表达明显增高，并表现出肌动蛋白细胞骨架明显重排且细胞运动能力明显增加15。在侵袭性较强的雌激素(ER)孕激素(PR)受体阴性的乳腺癌中，fascin的表达升高，且fascin高表达的病人较低表达者5年生存期短16。另一项研究结果发现鼻咽癌fascin1的表达与鼻咽癌患者的无病生存率呈负相关,和肿瘤的恶性程度呈正相关，提示fascin1在鼻咽癌中是一个独立的生存预后指标17。有学者研究发现膀胱癌中fascin1高表达，并且随着肿瘤浸润程度的加深，fascin1的表达水平也随着升高18。fascin1在平滑肌肉瘤中的表达较良性肿瘤明显升高，揭示其可以作为鉴别子宫平滑肌肉瘤的一个可靠的免疫标记物19。通过体外、体内试验发现fascin1均能促进A549细胞的迁移和侵袭，但对细胞的增殖没有明显的作用，fascin1在肺非小细胞肺癌的转移的重要作用，其将来可能的成为预防非小细胞肺癌转移靶基因20。最新报道，Park SH等人发现沉默fascin1的表达，能显著降低肿瘤细胞的增殖，迁移和侵袭能力，fascin1可能是卵巢癌预后不良的潜在标志21。上述情况提示 fascin1基因在肿瘤的侵袭和转移的过程可能扮演多种角色。 目前，国内关于胃癌中fascin1的表达及其意义的相关临床研究并不多见，因此，本研究通过检测正常胃粘膜细胞和不同分化胃癌细胞中fascin1mRNA和蛋白的表达水平；通过免疫组化SP法对80例胃癌标本及进行fascin1表达水平的研究，同时取距离肿瘤组织大于5cm的癌旁正常胃黏膜20例作为正常对照，并结合患者临床病理学特征，以期发现胃癌组织中fascin1的表达与患者临床病理相关参数可能存在的关系，发倔fascin1在胃癌发生、发展过程中作用的分子机制，为胃癌的基因治疗提供参考数据。第二章 材料和方法2.1材料2.1.1主要实验仪器及来源仪器名称厂家仪器名称厂家普通冰箱荣事达耐高温塑料切片架福州迈新生物公司精密PH计雷磁组织包埋仪亚光，YB-7B型电子天平民桥实时荧光定量PCR仪德国Eppendorf超净工作台北京亚泰隆可调微量移液器德国Eppendorf直热式二氧化碳培养箱上海三藤仪器制冰机日本SANYO倒置生物显微镜北京中显恒业器紫外分析仪UV18cm不锈钢苏泊尔压力锅细胞计数板上海安信光学仪器荧光板美国Thermo公司石蜡切片机莱卡公司（德国）水平琼脂糖电泳槽北京六一组织摊片烤片机湖北博大电子科技 -80冰箱中科美菱全自动HE染色机莱卡公司（德国）电磁炉福州迈新封片机莱卡公司（德国）恒温水浴箱J-MAX光学显微镜日本Olympus CX41摇床其林贝尔病理图像采集系统美国MOTIC定时器福州迈新生物公司医用微波炉福州迈新湿盒福州迈新生物公司2.1.2主要试剂及来源试剂名称公司试剂名称公司一抗美国Santa兔抗 fascin-1稀释度 1:300DL2000 DNA MarkerGenstarDMEM高糖培养基美国Gibco公司dNTP Genstar1640培养基美国Gibco公司SYBGREEN PCR Mix美国ABI胎牛血清（FBS）美国Gibco公司E.B.美国Sigma胰酶消化液美国Gibco公司免疫组化试剂盒福州迈新pbs溶液南京凯基生物公司柠檬酸盐缓冲液CB北京中杉金桥DMSO美国Amresco公司PMSF南京凯基生物冻存管美国Amresco公司-actin凯基无水乙醇国药集团化学试剂公司fascin-1引物上海生工生物10ul吸头axygen逆转录试剂盒康为世纪200ul吸头axygenEDTA美国Sigma1ml吸头axygenTris美国Sigma1.5ml离心管axygenTrizol美国Invitrogen15ml离心管corningTaq酶Genstar50ml离心管corningDEPC美国Sigma无粉乳胶手套光明25cm2培养瓶，6孔板corning青霉素-链霉素溶液南京凯基琼脂糖西班牙RIPA裂解液强南京凯基2.1.3 细胞 人正常胃粘膜细胞GES-1和胃癌细胞MKN45、MKN28、SGC-7901均购于南京凯基生物公司。2.1.4 临床资料全部病例来自中南大学湘雅三医院病理科2013年1月至2014年12月存档的石蜡包埋胃癌(均术后病理报告证实)手术切除标本共80例，男性48例，女性32例，平均年龄为54岁（32岁-77岁），80例具有完整临床及随访治疗，所有标本术前均未行放疗与针对肿瘤的化疗，同时取距离肿瘤组织5cm的癌旁正常胃黏膜20例作为正常对照。收集齐实验的患者所有与实验相关的临床病理资料。 2.2实验方法2.2.1 细胞培养 细胞培养间经消毒紫外线消毒30分钟后，换上洁净白大衣，戴好消毒的帽子口罩、无粉手套，方可进入细胞培养间。超净工作台使用前，使用酒精消毒一遍，紫外线照射消毒至少30分钟。2.2.1.1细胞复苏a.将恒温水浴箱加热到37，并将配制好的细胞培养基取出，置于超净工作台中恢复到室温。b.从液氮罐中取出一冻存管的细胞,迅速放入37水浴箱中,用无菌纱布或无菌手套包住冻存管口，不断摇晃,使之基本融化(水浴箱的水不能高过冻存管瓶盖),拿入超净台,吸出细胞加入到含5ml完全培养基的新离心管。c.离心管放入离心机，室温，1000 rpm/分钟，离心5min。d.弃去培养基，加入新鲜培养基重悬细胞沉淀(GES-1细胞培养于含10%胎牛血清和1%的青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基中,MKN-28，SGC-7901，MKN-45细胞培养于含10%胎牛血清的1640完全培养基中),轻轻打匀细胞，置于温度为37、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。e.第二天，更换新鲜完全培养基。2.2.1.2、细胞换液 传代后次日换液，以后每两天换液。a.从温箱中拿出细胞置于超净工作台上，首先将旧的培养基倒入废液缸，用无菌巴士吸管吸取5ml的PBS液入培养瓶，盖上瓶盖，轻微摇晃洗涤细胞，后将洗涤液倒入废液缸，一般洗两遍。b.加入5ml已配制好的新鲜的完全培基，轻轻摇晃瓶身，让培基将细胞表面完全覆盖。c.将换好液的细胞瓶盖喷些酒精，置于5%CO2饱和湿度，37培养箱中培养。2.2.1.3 细胞传代取在培养瓶内已经生长23天，细胞长到80%-90%融合时，再进行细胞传代。a.将培养瓶培养基吸尽，滴入废液缸,加5ml PBS洗涤两次,弃去洗涤液,加0.25%胰蛋白酶4-6滴,消化液均匀覆盖细胞表面,消化时间约1-3分钟。 b.消化后在倒置显微镜下观察，可见细胞变圆,细胞的边缘折光性增强,待培养瓶内的细胞大部分漂浮,立即加入含血清的培养基,终止消化过程。 c.用吸管将培养瓶壁上的细胞吹打下来,吸入新离心管，1000 rpm/分钟，离心5分钟后,弃去培养基,加入配制好的细胞培养基5ml，轻轻吹打细胞混匀, 细胞以1:2分瓶培养,当显微镜下观察细胞形成致密单层且长满培养瓶时即可进行下一次传代。2.2.1.4细胞冻存： 取在培养瓶内已经生长23天，细胞长到80%-90%融合时，最好在冻存前一天换液，以保证细胞处于良好的营养状态。a. 从37恒温箱拿出细胞，用巴士无菌吸管吸干培养基后，吸5ml磷酸盐缓冲液，平放轻摇洗涤细胞，重复洗涤三遍后，吸管吸干废液倒入废液缸。b. 胰蛋白酶消化细胞完全后，吸入新离心管，置于离心机1000 rpm/分钟，离心10分钟。 c. 弃去上清液，用配制好的冻存液重新悬浮细胞，并配成细胞悬液。 d. 吸管轻柔打匀细胞，后吸入无菌、已做好标记的冻存管内。 e. 然后将标记好的装有细胞的冻存管置于4冰箱内30分钟，后取出放入20冰箱1-2小时,再放入80冰箱过夜保存，次日再放入液氮罐中保存。2.2.2 RNA提取 将正常以上四组细胞分别种到25cm培养瓶，选择对数期、生长状态良好的细胞进行RNA的提取。超净工作台使用前，使用酒精消毒一遍，紫外线照射消毒至少30分钟后，戴上无菌手套，从37恒温箱拿出细胞，用巴士无菌吸管吸干培养基后，吸5ml磷酸盐缓冲液，平放轻摇洗涤细胞，重复洗涤三遍后，吸管吸干废液倒入废液缸。(实验前应准备好冰盒，整个过程应在冰上操作)a.分别加入1mlTrizol，注意枪混匀后室温裂解5min。细胞中加入0.2ml三氯甲烷，盖好EP管盖后，剧烈振荡15秒，于室温下，静置3-5分钟。b.离心，4，12000rpm,15min后，液体分为三层，移液器小心吸取上层水相液体，移入新的EP管，加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温静置10min。c.4，12000rpm，离心10min，离心前RNA沉淀不可见，离心后在EP管侧壁和底部可见白色胶状物沉淀。d.弃上清，沉淀中加入1ml75%乙醇（无菌DEPC处理水配制），颠倒混匀洗涤沉淀。e.4，7000rpm，5min低温离心，弃上清，置于空气干燥5-10min。加入20l无菌DEPC处理水溶解沉淀。完成以上步骤后，使用Eppendorf紫外分光光度仪测定提取的各组细胞的RNA浓度和纯度，细胞样本提取的RNA纯度在1.8-2.0范围内，则可用于后续实验或置于-80冰箱冻存备用。2.2.3 蛋白提取 a.(实验前应准备好冰盒，整个过程应在冰上操作)选择生长状态良好的细胞蛋白的提取，超净工作台使用前，使用酒精消毒一遍，紫外线照射消毒至少30分钟后，戴上无菌手套，从37恒温箱拿出细胞，用巴士无菌吸管吸干培养基后，吸5ml磷酸盐缓冲液，平放轻摇洗涤细胞，重复洗涤三遍后，吸管吸干废液倒入废液缸。b.用干净的细胞刮将细胞完全刮下，移液器迅速将细胞裂解物吸入新的EP管。c.现配细胞裂解液（10lPMSF+1mlRIPA裂解液），吸取80l裂解液滴入EP管，充分打匀后，冰盒上放置30分钟，注意每五分钟弹管。d.将EP管放入离心机，4，12000r离心10分钟，取上层水样液相入新的EP管，于-20冰箱冻存，备用。2.2.4 fascin1 mRNA的实时荧光定量PCR分析 2.2.4.1总RNA及miRNA的提取（如前诉）2.2.4.2 引物和探针设计Gene Sequence-actin 正向引物：5-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3 反向引物：5-TAATGTCACGCACGATTTCC-3fascin-122 正向引物: 5-CTGGCTACACG CTGGAGTTC-3 反向引物：5-CTGAGTCCCCTGCTGTCTCC -32.3.1.3普通逆转cDNA以细胞总mRNA为模板，进行逆转录cDNA，具体的反应体系、操作步骤和逆转录的条件参见下表（冰上操作）： 20l反应体系（0.2ml 无酶PCR tube管）10l 无菌DEPC处理水1l Random primer1l RNA（约3g）摇匀，70加热5min后，迅速插入冰中冷却。再依次加入：4l 5Reaction buffer2l dNTP1l RNase inhibitor摇匀后，37水浴加热5min。再加入：1l M-MLV逆转录酶（200units） 轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底，置于PCR仪上，设定反应程序，42，1小时30分钟,7210分钟，所合成的cDNA产物置于20冰箱内保存备用或继续后续实验。2.2.4.3 实时定量反应体系及反应程序 实时荧光定量PCR（每个样本每个指标设置3个复孔，共30ul体系，每孔10ul）体系组成： Composition Volume（ul） Template（反转录产物） 1Primer A （10uM） 0.5Primer B （10uM） 0.5PCR H2O 13 2X SYBGREEN PCR Master Mix 15本实验实时荧光定量PCR扩增程序具体如下： Temperature Time 预变性 95 10min40cycles变性 94 5s 退火/延伸 59 30s 待整个循环结束后，进行融点曲线分析。2.2.5 Western Blot法检测fascin1 蛋白的表达水平2.2.5.1 BCA法测定四组细胞的蛋白质浓度a.根据BCA试剂盒的说明书，将A液和B液以50:1的比例均匀混合，配制成我们需要的测定工作液。（注意：新配置的BCA工作液在室温下可稳定保存24小时）在配制工作液前，应该根据所要进行实验的蛋白样品的量来计算BCA检测试剂的使用量。b.选择微孔板检测，向96孔板的每孔加入200l的已配制好的工作液，充分混匀。c.首先稀释浓度为BSA蛋白标准品，浓度为2mg/ml，依次稀释浓度为25g/ml、125g/ml、250g/ml、500g/ml、1000g/ml、2000g/ml，以上诉六个稀释浓度画标准曲线。d.用PH7.4的PBS将提取到的以上细胞蛋白样品稀释100倍来进行测定。e.将稀释好的标准品分别加入相应的检测孔，每孔加入的标准品或待测的蛋白样品均为25l，轻轻混匀，每孔待测蛋白样品应作双份平行测定。f.盖上96孔板的盖，置于37的水浴箱孵育30分钟，冷却到室温。g.用酶标仪测定562nm波长，各孔样品的吸光度值；h.根据以上蛋白标准品吸光度值绘制标准曲线，再计算出每个待测样品的蛋白质浓度。2.2.5.2制胶a.胶板模型的安装：将玻璃板用自来水洗干净，在三条边上放好塑料条后，将另一块玻璃板压上，用两边的夹子夹紧。b.分离胶的制备：10分离胶溶液5ml的配制方法(成份为双蒸水1.3m1；30丙烯酰胺1.7ml；10SDS 005 ml；PH88，1.0molLTrisHCl1.9ml；TEMED 0002ml；10过硫酸铵005 ml)。c.用手将离心管轻摇混匀，用移液器小心将配好的分离胶液注入安装好的玻璃板的间隙中，加入量不能过高，要为浓缩胶留足够的空间，立即在玻璃板间隙顶层加入几毫升DEPC水覆盖，以阻止空气中氧对聚合的抑制作用，在室温下放置约2h，至分离胶完全聚合。d.浓缩胶的制备：5浓缩胶溶液2ml的配制方法(成份为双蒸水1.4ml；30丙烯酰胺0.33 ml；lOSDS 0.02 ml；PH68，10mol1 TrisHCl 0.25 ml,10过硫酸铵O05 ml；TEMED0.002ml)。e.首先，于玻璃板间隙的顶层将浓缩胶注入到已经聚合的分离胶上部，插入洁净的梳子，插入动作稍轻柔，此过程尽量避免产生气泡。f.室温下静置约1小时至浓缩胶完全聚合为止。g.等待浓缩胶完全聚合后，首先将凝胶模板插入电泳槽固定好，于电泳槽的上下槽均加入已配置好的Iris-甘氨酸电泳液(配制成份为25 mmollTrisHCl；250 mmoll甘氨酸；0.1SDS)，后小心地拔出玻璃板间隙的梳子，拔出之后注意用PBS清洗各梳孔，并检查各孔有无出现漏液，再小心去除玻璃板间隙分离胶底部的气泡。h.准备进行SDS-PAGE凝胶电泳。2.2.5.3 SDS-PAGE凝胶电泳A.于-20冰箱中取出保存备用的蛋白质样品解冻；b.将实验的目的蛋白样品与2SDS凝胶样品缓冲液(配制的成份：100 mmol1 DTT；2SDS；10甘油：PH68，50mmol1 TrisHCl；0.1溴酚蓝)等体积混合；c.置沸水(100)中加热3分钟，使蛋白质变性，迅速置于冰上冷却待用。d.点样：用移液器往凝胶梳孔中加细胞样品混合液，要根据样品蛋白浓度计算所加样品混合液的体积，两边的梳孔可以不用，其余梳孔分别加一个样品，同时用已知分子量的标准蛋白-actin作对照。e.注意电泳槽的接头应与电源的接头正极想接正极，负极相接于负极，然后接通电源，开始电泳。f.本实验电泳过程的起始电压强度是80V，当染色的标记物溴酚蓝迁移成一条线，表明进入分离胶)，迅速将电泳的电压大小调至120V，此时，电泳分离过程继续；g.当染色的标记物溴酚蓝迁移到凝胶的底部时，则拔掉电源，停止电泳过程。2.2.5.4电转膜a.将凝胶从电泳槽的玻璃板上取下，动作轻柔；b.立即放入转膜液(成份为0037SDS；20甲醇；39mmoll甘氨酸；48mmoll TrisHCl；)中浸泡5分钟，c.切取与分离胶长度相近的一段滤纸和硝酸纤维素膜放入转膜液浸泡，切胶，将切好的硝酸纤维素膜置于dd水中浸泡2 h（注意：切胶时要戴手套，以免手上的蛋白污染膜）。d.镊子轻柔清除去浓缩胶，分离胶覆于滤纸上，将硝酸纤维膜全部置于分离胶上，整个膜要盖满胶(注意膜覆盖到分离胶后，则不能再移动),膜上面需盖3张滤纸后除气泡。整个操作过程在转膜液中进行，且硝酸纤维膜两边的滤纸不能相互接触；e.按以上先后的顺序将它们置于转膜仪上，应该小心轻轻放置；f.清除所有气泡，后接通电源，以恒流0.29A转移90分钟，使相应蛋白质从负极向正极移动，转移至纤维素膜的相应区带位置。（转膜应在低温下进行，电泳槽应放入装满冰块的盆里，并尽量多加些冰块）2.2.5.5 免疫反应分析提取的蛋白质成分：a.切胶后，在室温条件下，将磷酸纤维膜置于含5%的脱脂牛奶（PBST20毫升和脱脂牛奶1克）的皿中封闭3小时。b.一块胶上加入特异性单克隆抗fascin-1抗体（原液：PBST=1：400配制）的皿，一块胶加入含内参-actin抗体（1:2000）的皿，室温下，水平摇床孵育3小时。c.4冰箱放置过夜，取出后置于含PBST的皿中，漂洗10分钟，后弃去洗涤液，共洗涤3遍10分钟。d.将磷酸纤维膜放入含辣根过氧化物酶酶标记的二抗（即兔抗IgG(1:2000)接的皿中，置于摇床成分反应1小时30分钟。e.然后用PBST漂洗共3次，每次10分钟，然后弃去洗涤液。f.显色：将显色液完全充分混匀后加入一个口容器中，向已经进行或免疫反应的硝酸纤维膜加入混合液，曝光6分钟。2.2.5.6 对提取的蛋白质成分的测定a.在凝胶成像处理系统上，对本实验的凝胶进行扫描、观察、拍照，记录灰度值。b.计算fascin1蛋白表达水平的相对值：fascin1蛋白表达水平相对值=fascin1目的蛋白OD值内参-actin OD值。2.2.5.7 统计方法 本实验过程重复三次，实验数据结果用每组的均数标准差（s）来表示，采用统计学软件SPSS20.0实验数据的分析处理，使用方差分析法比较试验各组间的数据差异。2.2.6 免疫组化SP法检测正常胃粘膜组织和胃癌组织fascin1蛋白的表达及其与临床病理参数的关系2.2.6.1 切片HE染色 80例胃癌和20例癌旁正常粘膜标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，将石蜡放-20冰箱冷冻后切片，每张切片厚度2.5m，60烤片40min，后将切片放入染色架后，采用莱卡自动染色机脱蜡、水化后常规HE染色，以便HE结合免疫组化观察fascin1的表达情况。2.2.6.2.免疫组化SP法 （1）准备切片：石蜡放-20冰箱冷冻后切片，厚度2.5m，60烤片40min，切片放入染色架后，采用莱卡自动染色机脱蜡、水化。 （2）PBS冲洗磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，每次5分钟，小心甩去切片上的磷酸盐缓冲液，卫生纸擦干组织周围的液体。 （3）每张切片滴加50l过氧化物酶阻断剂，用盖玻片将试剂抹匀让切片上的组织完全覆盖。切片放入湿盒内，室温下孵育10分钟，磷酸盐缓冲溶液冲洗3次，每次5分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （4）抗原修复：将配制好的柠檬酸盐修复液，倒入压力锅中（一般20张片子以内倒800ml柠檬酸盐抗原修复液），放置于电磁炉上，以“火锅”模式，大功率(1800w)加热至沸腾，将放置好组织切片的耐高温高压的染色架迅速放入高压锅中，一般抗原修复液需覆盖组织切片，此时将功率调到中度（800w)，盖上锅盖，当压力锅开始喷气计时2分钟后，将高压锅离开电磁炉，自然冷却10分钟，打开锅盖取出染色架，打开自来水水龙头，流水在压力锅外壁冲淋以加速冷却，当冷却至室温后取出切片，磷酸盐缓冲液洗涤2次，每次5分钟，然后进入染色程序。（5）拭去组织切片上的磷酸盐缓冲液，每张切片滴加50l10 %正常山羊非免疫血清，室温下孵育10分钟，直接甩去。（6）切片上滴加50l一抗，fascin-1抗体 (原液1300稀释)，切片放置于湿盒内，置于4 冰箱过夜。（7）次日，取出切片，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min。（8）甩去组织切片上的磷酸盐缓冲液，切片上滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育20分钟，磷酸盐缓冲液冲洗3遍，每次5min。（9）除去 PBS 液，每张切片加 100l 已配制好的 DAB 显色液，作用 3 min，染色结果为棕色（配制好的DAB应避光存放，30分钟内有效）。（10）磷酸盐缓冲液冲洗终止显色，置入苏木素中复染约1min，再用自来水冲洗干净，吹风机吹干切片，莱卡自动封片机封片，显微镜下观察。 硕士学位论文 材料和方法2.2.6.3 本实验染色判断标准由两名病理科主任医师在未知患者临床资料的情况下，分别进行染色结果判定，免疫组化评分由两部分组成：即免疫组化总评分=阳性细胞数评分（A）染色强度评分（B），最后得分0分判定为阴性（-），1-2分为弱阳性（+），3-硕士学位论文 材料和方法4分为中等阳性（+），6-9 分为强阳性（+）。 阳性细胞数评分（A）：光学显微镜下每张切片随机选取5个视野，每个视野计数100个细胞，阳色细胞数所占百分数比规定为A，阴性或5% 阳性细胞表达计0 分，5%-25% 计1分，25%-50% 计2分，,50%-75%计3分，75%计4分。细胞染色强度评分(B)：fascin-1 阳性主要为胞膜和胞浆着色，为棕色信号。染色强度分为4级：细胞无显色：0 分；浅棕色：1 分；着棕色：2 分；深棕色：3 分。2.2.6.4 临床一般资料与临床病理资料的统计结果：运用统计学软件SPSS20.0对数据进行统计分析，采用等级资料的非参数秩和检验和x检验进行分析，检验水准a=0.05,所有结果以双侧P0.05为有统计学意义。硕士学位论文 结果第三章 结 果3.1 实时荧光定量PCR结果 实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团,整个PCR进程利用荧光信号积累进行实时监测,结果利用标准曲线对未知模板进行绝对定量或利用Ct法进行相对定量分析。RT-qPCR在定量起始模板浓度具有专一、灵敏、快速、精确的特性。RT-qPCR常用的化学原理有两种:一种是染料法,另一种是探针法。其中，染料法使用的是SYBRGreenI ，它是一种双链DNA结合染料。与双链DNA结合后,其荧光大大增强。本实验使用燃料法，实验过程中加入的SYBR荧光染料后，能发射强荧光信号一旦其特异性地掺入DNA双链，保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加同步，PCR程序每循环一次就收集一个荧光强度数据,建立实时扩增曲线,准确地确定Ct值(Ct值:是指每个反应管内的荧光信号达到实验设定的域值时所经历的循环数），从而根据Ct值确定实验起始DNA的拷贝数,真正意义上，做到的DNA定量。由于Ct值是一个完全客观的参数,Ct值越小,说明模板DNA中的目的基因越丰富。在RT-qPCR扩增反应中，荧光扩增曲线图主要分为4个特征性阶段：基线期、指数期初期、指数期和平台期。从图看出，分析软件显示本实验的荧光扩增曲线形状是一条平滑的S型曲线，提示RT-qPCR反应程序在正常运行，使得实验的目的基因得到了有效扩增，实验的操作步骤规范，试剂符合我们的实验要求。图中可以看出，本实验的熔点曲线在软件中显示只有一个峰值，并没有出现杂峰，提示产物扩增过程无非特异性荧光信号的干扰，目的基因的扩增产物单一，有利于后续的结果分析。反应管内荧光信号强度达到设定阈值所经历的循环数(Ct值)与扩增起始模板量存在线性对数关系。本实验通过相对定量公式2-Ct，计算出fascin-1的表达水平相对于正常胃粘膜的变化情况。图 正常胃粘膜上皮细胞及三种胃癌细胞fascin1的扩增曲线图 正常胃粘膜上皮细胞及三种胃癌细胞fascin1的溶解曲线细胞名称GES-1MKN28SGC-7901MKN45fascin1 mRNA相对表达水平0.25土0.090.53土0.171.68土0.213.79土0.54P1P0.052P0.053P0.054P0.05表3-1 fascin1 mRNA在四组细胞中表达的比较：1正常胃粘膜与各组胃癌细胞比较 2正常胃粘膜与高分化胃癌细胞比较 3高分化与中分化胃癌细胞比较 4中分化与低分化胃癌细胞比较图 正常胃粘膜细胞株和不同分化胃癌细胞株中fascin-1mRNA相对表达量（*PO.05），结果显示所有癌组织中fascin-1的