EBV病毒 .ppt

Epstein-BarrVirus,1,EB病毒,Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，故名。EB病毒（Epstein-BarrVirus,EBV），又称人类疱疹病毒（HumanHerpesvirus4,HHV-4）。EBV属于-疱疹病毒亚科，淋巴潜隐病毒属,双链DNA病毒，人是EBV的惟一天然宿主。,2,疱疹病毒,疱疹病毒Herpesviruses双股DNA病毒，有100个以上成员，根据其理化性质分为、三个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。引起人类产生的有7种疱疹病毒。疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织。感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向，严重威胁人类健康。,3,疱疹病毒分类,疱疹病毒（如单纯疱疹病毒、水痘一带状疱疹病毒）增殖速度快，引起细胞病变。疱疹病毒（如巨细胞病毒），生长周期长，感染细胞形成巨细胞。疱疹病毒（如EB病毒），感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生。,4,引起人类产生疱疹病毒,5,单纯疱疹病毒,单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)，分为HSV-1和HSV-2两种，-疱疹病毒。HSV-1型主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官。如引起口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹，99%是由型疱疹病毒感染引起的；HSV-2型则引起生殖器疱疹,而且主要通过直接接触病灶(性接触)而传播,并导致皮肤病变。,6,水痘-带状疱疹病毒,水痘-带状疱疹病毒（Varicellazostervirus，VZV）属-疱疹病毒，人疱疹病毒3型。水痘-带状疱疹病毒（VZV）感染可导致的两类临床疾病：分别为水痘和带状疱疹其原发感染为水痘，潜伏再度激活则引起带状疱疹。VZV自然感染人体后，大多数表现出终身免疫，也有极少数人会再次感染。潜伏体内的病毒受到某些刺激后复发引起起带状疱疹，多见于成年人和老年人。,7,巨细胞病毒,巨细胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)，疱疹病毒，人疱疹病毒5型分布广泛，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。CMV在人群中感染非常广泛，我国成人感染率达95%以上，通常呈隐性感染，多数感染者无临床症状，但在一定条件下侵袭多个器官和系统可产生严重疾病。妊娠母体CMV感染可通过胎盘侵袭胎儿引起先天性感染，少数造成早产、流产、死产或生后死亡。,8,可以开展荧光PCR的品种,HSV-1和HSV-2合并检测HSV-1HSV-2HCMVEBVVZV,9,外周血（PeripheralBlood）是除骨髓之外的血液。血液是流动在心脏和血管内的不透明红色液体，主要成分为血浆、血细胞。血液有四种成分组成：血浆，红细胞，白细胞，血小板。,10,11,全血(wholeblood)由液体成分的血浆和悬浮于其中的血细胞组成，合成为全血。血浆(plasma)离开血管的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，即血浆。血清(serum)血液不经抗凝处理，让他自行凝固，则在抽血后的一段时间内，血液会自动在一系列凝血因子的作用下发生凝集，血液首先凝固成一个整体，再经过一段时间或用离心机离心，血液中凝固的部分会与一些清澈淡黄色的液体分离开，这些液体称为血清。血清与血浆的区别，主要在于血清不含纤维蛋白元。纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用。,12,13,白细胞,白细胞（leukocyte,whitebloodcell）为无色有核的球形细胞，体积比红细胞大，能作变形运动，具有防御和免疫功能。成人白细胞的正常值为400010000个/l.根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞用嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。,14,中性粒细胞,中性粒细胞（neutrophilicgranulocyte,neutrophil）占白细胞总数的5070，是白细胞中数量最多的一种。细胞呈球形，直径1012m，核染色质呈团块状。中性粒细胞具有活跃的变形运动和吞噬功能。,15,嗜酸性粒细胞,嗜酸性粒细胞（eosinophilicgranulocyte,eosinophil）占白细胞总数的0.53。细胞呈球形，直径1015m，核常为2叶，胞质内充满粗大（直径0.51.0m）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色。嗜酸性粒细胞也能作变形运动，并具有趋化性。它能吞噬抗原抗体复合物，释放组胺酶灭活组胺，从而减弱过敏反应。,16,嗜碱性粒细胞,嗜碱性粒细胞（basoophilicgranulocyte,basophil）数量最少，占白细胞总数的015。细胞呈球形，直径1012m。胞核分叶或呈S形或不规则形嗜碱性颗粒内充满细小微粒，呈均匀状或螺纹状分布。颗粒内含有肝素和组胺，可被快速释放；而白三烯则存在于细胞基质内，它的释放较前者缓慢。,17,单核细胞,单核细胞（monocyte）占白细胞总数的38。它是白细胞中体积最大的细胞。直径1420m，呈圆形或椭圆形。它是白细胞中体积最大的细胞。直径1420m，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则形等。单核细胞是巨噬细胞的前身，它在血流中停留15天后，穿出血管进入组织和体腔，分化为巨噬细胞。,18,淋巴细胞,淋巴细胞（lymphocyte）占白细胞总数的2030，圆形或椭圆形，大小不等。径68m的为小淋巴细胞，912m的为中淋巴细胞，1320m的为大淋巴细胞。根据它们的发生部位、表面特征、寿命长短和免疫功能的不同，至少可分为T细胞、B细胞、杀伤（K）细胞和自然杀伤（NK）细胞等四类。,19,T细胞、B细胞,血液中的T细胞约占淋巴细胞总数的75，它参与细胞免疫，如排斥异移体移植物、抗肿瘤等，并具有免疫调节功能。B细胞约占血中淋巴细胞总数的1015。B细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞，产生抗体。负责体液免疫的细胞是B细胞。,20,外周血单个核细胞,外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬。,21,22,23,EBVhasa173kbDNAgenome.EBViscapableofinfectingBandTlymphocytes,squamousepithelialcells.EBVinfectsnearlyallhumansbythetimetheyreachadulthood.50-90%individualsbecomeseropositiveforEBVbyyoungadultlifeworldwide.Healthyviruscarriersharbor1to50EBVgenomespermillionbloodmononuclearcells.,Epstein-Barrvirus,24,EBV-RelatedDisease,BurkittslymphomaHodgkinslymphomanasalnaturalkiller(NK)celllymphomanasopharyngealcarcinomapost-transplantlymphoproliferativedisorder(PTLD),25,EBVInfection,EBVinfectsandispropagatedbyBlymphocytes.OnlyonevirioncansuccessfullyinfectagivencellThelinearviralgenomecircularizesbyjoiningterminalrepeatsequencestoformanepisomeThisepisomalDNAislocalizedtothenucleus,andonlyrarelyisitintegratedintohostchromosomalDNA,26,EBVenterstheBcell,themajorenvelopeglycoprotein,gp350,bindstotheviralreceptor,theCD21molecule(theC3dcomplementreceptor)themajor-histocompatibility-complex(MHC)classIImoleculeservesasacofactorfortheinfectionofBcellsPatientswithX-linkedagammaglobulinemialackmatureBcells,andtheirBcellscannotbeinfectedwiththeviruseitherinvitroorinvivo.,27,28,GeneexpressedinlatentlyinfectedBcells,Ofthenearly100viralgenesthatareexpressedduringreplication,only10areexpressedinlatentlyinfectedBcellsinvitro.TwotypesofnontranslatedRNA,sixnuclearproteins,andtwomembraneproteinsEBVreducesthenumberofviralproteinsthatpermittherecognitionofinfectedcellsbycytotoxicTcells.,29,EBVnuclearantigen(EBNA),EBNA-1proteinbindstoviralDNAandallowstheEBVgenometobemaintainedintheBcellasacircularDNAepisome.EBNA-2up-regulatestheexpressionofEBVlatentmembraneprotein(LMP)1andLMP-2.EBNA-3proteinsalsoregulatetheexpressionofcellulargenes.EBNAleaderproteinaugmentstheabilityofEBNA-2toup-regulateLMP-1.,30,LatentMembraneProtein(LMP)1,2,LMP-1actsasanoncogene,andexpressionofthisproteinintransgenicmiceresultsinB-celllymphomas.LMP-1bindstoseveralofthetumornecrosisfactorreceptorassociatedfactors.EBVLMP-2preventsreactivationofEBVfromlatentlyinfectedcellsbyblockingtyrosinekinasephosphorylation.,31,EBV-encodedRNA(EBER),ThenontranslatedtypesofEBV-encodedRNA(EBER)donotencodeproteins,buttheymaybeimportantforoncogenesisandresistancetoprogrammedcelldeath,orapoptosis.EBER-1,isdetectableinvirtuallyallEBV-infectedcellsandisexpressedatveryhighlevels,reaching107moleculespercell.,32,33,PATTERNOFLATENCY,EBNA-1andEBEREBNA-1,LMP-1,LMP-2,andEBERAllthelatencygenesareexpressedEBERandLMP-2,andinsomestudies,EBNA-1RNAhavebeendetected.,34,35,RepresentativemethodstomeasureEpsteinBarrviral,36,鼻咽癌,鼻咽癌是指发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤。中国的广东、广西、福建湖南等地为多发区，男多于女。发病年龄大多为中年人，亦有青少年患病者。病因与种族易感性(黄种人较白种人患病多)、遗传因素及EB病毒感染等有关。鼻咽癌恶性程度较高，早期即可出现颈部淋巴结转移。,37,NasopharyngealCarcinoma,NasopharyngealcarcinomaisprevalentinsouthernChina,innorthernAfrica,andamongAlaskanEskimos.InsouthernChina,approaches50per100,000personsperyear.Nearly100%ofanaplasticorpoorlydifferentiatednasopharyngealcarcinomascontainEBVgenomesandexpressEBVproteins.,38,PTLDpost-transplantantlymphoproliferativedisorders移植后淋巴增殖异常作为器官和细胞移植后发生的最严重的并发症之一。认为PTLD并不是一个独立的疾病，而是包括多种疾病形式的综合征，尽管在发病机制上多数与EB病毒有关，但各种疾病形式之间存在不同的生物学和临床特征。,39,PTLD,PTLD是器官移植和骨髓移植后的严重并发症之一，病理表现为淋巴细胞增生紊乱，形成淋巴瘤。PTLD的好发部位主要是淋巴结、移植器官、小肠和中枢神经系统，以移植后2年内最常见。EB病毒阳性的PTLD的发生较EB病毒阴性的早。PTLD绝大多数来源于B淋巴细胞(约87)，少数来源于T淋巴细胞(12)。B淋巴细胞来源的PTLD多数呈EB病毒阳性，而T淋巴细胞来源的PTLD仅38呈EB病毒阳性。,40,PTLD,PTLDpathogenesisdiffersbetweenstemcellandsolidorgantransplants.ThehighEBVloadhassomepositivepredictiveandaverygoodnegativepredictivevalue,particularlyifthegraftwasT-celldepleted.,41,42,43,44,实验设计,开发EBV荧光PCR试剂盒主要针对我国高发的鼻咽癌和PTLD。EBV感染与鼻咽癌的发生密切相关，在大部分角化鳞状细胞癌和几乎所有未分化的鳞状细胞癌都有EBV的存在。器官移植后，免疫抑制剂治疗可能促进被EB病毒感染的细胞的扩散。当免疫抑制反应减弱时可消退。,45,目的基因的选择,目的基因(internalrepeatIR1)BamH1w重复序