HPLC常见问题学习经验分享PPT课件

-,1,HPLC常见问题,学习经验分享,-,2,流动相在线吸滤头,安捷伦单晶玻璃滤头（石英砂芯）,岛津烧结不锈钢滤头（俗称沉子）,-,3,材质：玻璃砂芯、不锈钢烧结（或陶瓷）,规格：5-20m,功能：滤除流动相中的固体杂质，防止较大固体不溶物进入液相色谱系统,日常维护,现象：管路中不断有起泡生成，柱压升高或上下波动,故障：吸滤头污染、堵塞,措施：玻璃砂芯：吸滤头取下，30-40%硝酸溶液浸泡（24小时以内），用蒸馏水清洗中性，再用甲醇清洗保存不锈钢烧结：用异丙醇（或5%稀硝酸）进行超声波浴清洗，再用蒸馏水清洗至中性,-,4,系统漏液！一般多为色谱柱与peek头螺旋连接处；若系统已经报警，检查为漏液后，一定检查柱温箱漏液传感器是否残留液体，若有擦干或晾干即可。脱气完成后Purge阀记得拧紧哪！,实验开始前柱压升高后又逐渐降低，此为正常，可能与色谱柱尚未平衡好有关；若一直居高不下，则考虑可能管路中部分堵了，一般从检测器开始反向逐步排查。容易堵的部分：流动相吸滤头、过滤白头、各种阀。,柱压,无柱压或柱压突然下降：,柱压升高：,-,5,首先考虑系统是否引入气泡。流动相超声后，一般还要进行在线脱气处理（purge），purge时，一定要从吸滤头处开始观察，看吸滤头内部及管路内是否有气泡。有时因为吸滤头倾斜角度关系，其内部的气泡一直无法排去，而在后期的实验中存在不确定性，因此需要我们手动操作。,柱压上下波动：,其次，考虑有机相和缓冲盐的比例是否合适？盐少量析出可能会导致柱压波动性下降；长时间的话波动性下降后将不能恢复至初柱压。,若流动相长期使用乙腈，则要考虑到乙腈的聚合沉积问题。可打开purge阀，大流速冲洗30min。养成良好的操作习惯，使用完乙腈后立即用甲醇把乙腈通道的乙腈充分置换出来，不要使乙腈在一个通道内长时间滞留。,-,6,空白溶剂,在保证样品溶解的前提下，尽量使溶剂的极性略大于流动相的极性，即溶剂的洗脱能力小于流动相。例如，当用大比例有机相（如纯甲醇、纯乙腈）溶解样品，而流动相中水相占一定比例进行洗脱时，单一纯物质容易出现双峰。,空白溶剂峰应对待测样品峰及其他杂质峰无干扰，即保证一定的分离度。进行样品分析前一般先进空白溶剂，再进样品，以辨认溶剂杂质峰及后补空白溶剂时可能会有残留样品干扰。,考虑对待测样品的溶解性：,考虑对待测物质是否存在干扰：,-,7,问题1：死体积（死时间）之后的洗脱中出现的溶剂峰？,一般，溶剂出峰时间都在3-5min，即溶剂从进样器到达检测池所通过的死体积所需时间。,死体积（死时间）之后的洗脱中出现的溶剂峰，一般应先考虑是否为其他因素造成的。如所用试剂影响、样品残留、滤膜过滤引入杂质等，其中流动相主要为水的问题（易污染、含其他杂质）,问题2：空白溶剂峰与样品溶液溶剂峰保留时间一致，但峰强度（峰高）不一致？,几种可能？样品溶液溶剂峰强度高于空白溶剂峰：样品溶液溶剂峰强度低于空白溶剂峰：,-,8,梯度洗脱,溶剂的互溶性：有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶，尤其使用缓冲盐时应特别小心。例如，乙腈和1mol/L的醋酸铵溶液（pH5.16），当乙腈含量超过70%，就会出现盐的析出现象。,混合溶剂的粘度：混合溶剂的粘度常随组成变化而变化，故在梯度洗脱时常会出现压力变化。例如，甲醇和水的粘度都较小，但当二者以相近的比例混合时，柱压升高近一倍。,关于基线：以某一流动相平衡色谱系统后，基线一般应为一平稳直线。梯度洗脱时，流动相组成发生变化，柱压也跟着改变，便会出现基线漂移。,-,9,梯度洗脱常见问题：基线漂移和易出现杂峰！,基线漂移多与梯度洗脱时流动相组成发生变化，柱压改变有关。一般在满足分离要求、分析时间的前提下洗脱梯度应尽量缓和。若不得已要求梯度急剧改变时，应尽量保证待检测组分不在柱压变动、基线波动阶段洗脱出峰（空白溶剂不好扣除）。,梯度洗脱多为从大比例水变成大比例有机相，出现杂峰的几种可能：色谱柱残留、水相盐析、梯度变化剧烈、流动相混合不均匀、流动相改性剂有一定紫外吸收等等。,-,10,冲管路,将封存好的色谱柱取下，换上二通。将两个泵吸滤头