薄层色谱法的发展.doc

薄层色谱分析法的应用和发展一、薄层色谱分析在层析分离过程中的应用 生物技术 、新型材料技术 、信息技术是当今科技发展的前沿 ,在某种程度上甚至可以代表一个国家的科学技术发展水平 。层析分离过程是生化产物分离和纯化的重要手段之一 ,作为生物技术产业化进程中的“下游技术”往往成为技术和经济的关键 , 直接关系到产品的产量和质量 ,其成本经常占到总成本的60 %90 %2 。因此 ,层析分离过程的优化和控制就显得十分重要。薄层色谱分析方法 , 因其具有分析迅速快 、成本低廉 、可现场操作等特点在层析分离过程中不可缺少。 1. 薄层色谱分析的优越性 薄层色谱分析方法和高效液相色谱分析方法均遵循层析分离的基本原理 ,因此 ,层析分离过程的中间控制性分析和分离后的最终产物的检验 ,用上述两种分析方法是非常适合的。高效液相色谱分析方法的精度高 、分离效能高 、选择性高 、检测器灵敏度高 , 比较适合最终产物的检验 。虽然高效液相色谱也可用于中控分析 ,但是分析检验的成本非常高，需要设置专业人员进行分析操作 。由于样品在分析前需要预处理 ,得到分析结果的时间相对较长 ,对于层析过程的中间控制就显得不够及时 , 同时过高的分析精度也没有必要 。薄层色谱分析方法在对层析分离过程控制性分析中就显示出了很高的优越性。2. 薄层色谱片的制作和分析操作 用于层析分离过程的中间控制性分析的薄层色谱片可以在专业试剂商店买到 ,如果在实验室自己制备则可节约80 %的成本, 同时可以根据分析的实际需要灵活地调整固定相薄层的配方。固定相通常用 GF254 硅胶和一定比例的纤维素配合而成。将固定相的浆料均匀地涂布在毛玻璃片上，经烘干活化后即可使用。每片薄层可以分析多个样品，重复使用几次。经毛细管点样、在层析缸用展开剂展开后 ，在紫外分析仪上可观察到非常清晰的分析结果，一次分析过程基本可控制在 10min左右，现场操作人员经短时间的培训就可掌握。3. 薄层色谱分析对层析分离过程的优化 应用薄层色谱进行层析中间控制分析，选用展开剂和确定不同展开剂的比例是薄层分析的关键。展开剂的确定一般需要以下几个前提条件： （1）层析前的样品要经过高效液相色谱分析，获得较高的分离度。 （2）确定样品中各组份的组成，明确层析分离要得到的主产物。 （3）层析分离过程的操作方法及洗脱剂的配比要基本确定 ,各组份的洗脱次序要明确。 （4）层析分离要得到主产物的纯度要规定一个在工艺上比较合理的范围（关系到最终的收率和产品质量）。 （5）层析分离后的主产物和副产物要经过高效液相色谱分析，确定产物的含量。 其中（1）和（2）通常也是必不可少的工艺条件，可以和薄层色谱分析结果相互印证。在上述前提条件具备后，可以根据样品的理化性质，选用几组常用的展开剂，分别用层析前和层析后的样品进行试验。选定一组分离效果较好的再进行微调 , 以围绕主产物能获得一个较好的分离度为准 。所获得的分离度并非越高越好 ,因为通常情况下最初确定的层析分离过程本身为薄层分析提供了足够的时间和组份之间的空间。我们利用薄层分析方法对层析过程进行监控的另一个很重要的一个目的在于，减少这种时间和空间，从而缩短层析分离过程的时间、降低洗脱剂的用量，扩大最终产品的利用空间。薄层分析的这种作用在产品试制和工艺放大过程中是非常显著。例如 :用硅胶层析柱（40400）分离一种新型高效生物农药（各组份分子量在8001000之间）小试产品时，用自制的薄层片对层析过程进行控制性分析，并进一步优化层析过程。最终使层析时间缩短了20 %，洗脱溶剂乙醇、乙酸乙酯的用量分别减少了10%和15%。4. 层析分离过程中应注意的问题 层析分离操作中,层析柱制备好后一般都要多次使用，层析柱的承载能力和分离效能是逐渐下降的。在层析操作方法和薄层分析方法确定下来后，要注意分析频次只能做一个基本的规定。因为同一 批制备的层析柱，在使用过程中分离能力的衰减速度往往是不同的，不排除某一个柱子突然失效的可能。所以在薄层分析中要注意这一点，根据实际情况调整分析频次，工艺人员也要有相应的预案。薄层分析结果与高效液相色谱分析结果对照时，要注意两种方法所采用固定相的差异，确定好各组份的次序。5. 结论 薄层色谱分析方法对层析分离过程的控制性分析和优化作用是十分显著的。近年来，随着生物制品的研制和中药制剂的开发，薄层色谱分析方法作为一种快速、高效、简便、低成本的分析方法，将有更加广阔的应用前景。 二、薄层色谱分析法在药物分析中应用进展 薄层色谱法 ( TL C)是将供试品溶液点样于薄层板上，经展开，检视所得的色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。TL C是一种快速、灵敏、高效地分离微量物质的方法，是最简单的色谱技术之一，具有操作方便、备简单、离效率高、属性好、分析速度快、色谱参数易调整等特点，在药物分析中应用广泛。 1药品真伪鉴别1.1 化学药品及其复方制剂 阿片中含生物碱 20余种 ,其含量差异较大。徐明琴等 1 将TL C用于阿片类药物及其代谢产物的检测。以硅胶为吸附剂 ,为展开剂 ,显色方法为 254nm紫外灯、碘化钾试剂、酸性碘铂酸钾试剂、蒸气等。通过选择适当的薄层板、开剂、色剂 ,与标准对照品比较比移值 ( R f )和斑点大小 ,可初步确定阿片类药物的种类。复方降压胶囊中 ,组成成分近 10种 ,董海彦 2 以TL C同时鉴别处方中利血平、利眠宁和盐酸异丙嗪 3种成分 ,取 3种对照品及供试品制成溶液 ,分别点于硅胶 GF 254板上 ,以苯 -丙酮 ( 32)为展开剂 ,展开后 ,晾干 ,置 254nm紫外光灯下检视 ,供试品与对照品 3个斑点位置一致 ,R f值适中 ,斑点明显。薄层色谱中展开剂应尽量不使用毒性很大的溶剂。苯毒性较大 ,有致癌作用 ,除了必要情况下 ,尽量用其它溶剂代替。此方法展开剂中的苯 ,如能以其它溶剂替代则更好。钱丽华等 3 采用薄层色谱法在同一薄层板上对抗结核类药物中的 4种主要成分利福平、异烟肼、盐酸乙胺丁醇、吡嗪酰胺进行快速分离鉴别。使用硅胶GF254板，以甲醇-水-浓氨水（30:1:0.3）为展开剂 ,点样量为 2l ,展开晾干后 ,先在紫外灯 ( 254nm)下检视 ,可见利福平、烟肼、嗪酰胺 3个斑点 ,再进行碘熏蒸 ,可见利福平、异烟肼、盐酸乙胺丁醇 3个斑点 , Rf值适中 ,分离效果和重现性好。吕长淮、阿利等对氨咖黄敏胶囊 TL C鉴别方法进行改进，分别通过改变展开剂配比、取样量及色谱条件。使原标准中未检出的成分得以检出。1.2 抗生素及其制剂 麦迪霉素片原标准TLC操作上受温度影响较大，所需硅胶H板较为特殊，显色剂配置繁琐。陈庆坤通过试验，该吸附剂为硅胶GF254，在室温下展开即可，样品展开后，置紫外光灯254nm下检视，供试液所显斑点的位置与颜色和对照液所显斑点相同，Rf值为0.5，斑点清晰，无拖尾现象，灵敏度高，分离效果好。金建平通过采用乙醚溶液四环素眼膏和眼膏基质，盐酸提取的方法处理样品，将对照品和样品制成适宜溶液，分别点于同一硅藻土G板上，以5%乙二胺四醋酸二钠溶液5ml与醋酸乙酯-氯仿-丙酮（2:2:1）200ml的混合液为展开剂。展开后，热空气中干燥，氨蒸汽熏，置紫外灯365nm下检视。结果，供试液所显斑点的颜色和位置与标准液所显的斑点相同。1.3 中药材 黄玉清采用TLC鉴别牡丹皮及其伪品芍药根皮，取牡丹皮、芍药根皮粉格1g，用乙醚提取后挥发，残渣加丙酮溶解，作为供试液；另取丹皮酚、芍药苷分别加冰铜溶液制成对照液。分别点与同一硅胶G板上，以环己烷-乙酸乙酯（3:1）为展开剂。展开后，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，牡丹皮供试液与丹皮酚对照液位置上显相同的紫色斑点，芍药根皮供试液与芍药苷对照液相应的位置上显相同的蓝色斑点。2. 药品杂质检查 有关物质检查通常采用色谱法，可根据有关物质的性质，选用专属性好，灵敏度高的TLC法、高效液相色谱HPLC法及气相色谱法GC法 。TLC法设备简单，操作简便，但影响重现性和精密度的因素较多，用作一般有关物质检查。施亚琴等采用反相薄层色谱法，建立了阿德福韦酯有关物质检查法。以反相高效F254薄层吧板（HP TLC RP18F254）为吸附剂，以甲醇-水3：1为展开剂，在紫外光灯254nm下检视，阿德福韦酯与其有关物质的分离状况良好，检测灵敏度高，最小检测限为0.1g。涂莉等采用TLC法，建立了雌三醇栓中有关物质的检查方法以硅胶G板为吸附剂，以氯仿-甲醇-丙酮-冰醋酸（9：0 5 ：0 5 0 5）为展开剂, 展开后，晾干，喷以30%硫酸乙醇液，在100 加热至斑点清晰 。结果，3种有关物质与原药完全分离，Rf值适中，最低检出量为0.2g ,且重现性好。毕雪艳等采用TLC法检查复方氨酚烷胺颗粒中的有关物质对氯苯乙酰胺，使用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)GF254硅胶板,以氯仿-丙酮-甲苯(13:5:2)为展开剂，紫外光灯254nm下检视。结果，检出对氯苯乙酰胺杂质斑点与其它主药成分斑点分离良好，空白样品溶液的斑点对杂质斑点无干扰，重现性好，Rf值适中,能有效检出有关物质。3. 中药指纹图谱分析 中药指纹图谱可有效反映中药成分的复杂性,表征中药质量。其作为中药质量准的一个方面，广泛用于鉴别样品的真伪或产地，有效成分研究等方面，色谱法中药指纹图谱的主流，主要有GC、HPLC、TLC等。TLC因其便宜、快速、开放性 、灵活性等优点，用于中药指纹图谱分析。3.1中药薄层图像指纹图谱 TLC的一大优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，特征图像直观，专属性好，判断速度快，非常适合基层日常分析与现场检验使用。广藿香主要含萜类、黄酮类、醇、酸、铜、醛类等化合物，广藿香不同提取部位具有不同的药物效应。袁旭江等研究不同产地广藿香药材薄层色谱指纹图谱的差别，取不同产地广藿香品6个，采用TLC检测其化学成分。结果,不同产地广藿香挥发油部位中成分薄色谱行为相似，不同产地广藿香甲醇提取部位与石油醚提取部位成分则存在明显差异。3.2薄层扫描指纹图谱 薄层扫描仪具有原位扫描功能,通过测量薄层色谱Rf值，原位紫外-可见吸收谱 ，结合板上化学特征反应形成薄层扫描中药指纹图谱。崔淑芬等使用薄层扫描法测定不同品种和产地的甘草并建立了指纹图谱可快速判断药材品质有控制甘草质量 。 4. 结语 薄层色谱法专属性好，分析速度快，设备简单，操作方便，不仅广泛应用于药物分析中的鉴别和杂质检查，还用于基层快检，大大提高了药品抽样阳性率。随着现代薄层色谱技术的发展，每一个环节都实现了自动化，部分弥补了其重现性分辨率的不足，使得薄层色谱在中药指纹图谱及手性药物拆分等研究方面备受关注 ，其研究领域将更加广阔。 三. 薄层色谱的发展与教学方法改进 自20世纪60年代薄层色谱取代纸色谱技术，至今已50余年的发展历史。薄层色谱法现已广泛应用于医药工业、临床医学、环境科学、食品科学、化学化工等各个生产领域，分离对象也无所不包。在大学教学中，基础课 有机化学便开始教授，各专业课也常常涉及。近10年来，薄层色谱技术已有了迅猛的发展，教学内容与方法也应不断改进，以符合“教育发展必须与社会经济发展相适应 ”的规律，使学生及时掌握新知识、新技术和新方法。 1. 薄层色谱应用领域扩大 薄层色谱最早用于草药、植物等的鉴别。其方法简便、快速、灵敏，成本较低。随着薄层色谱技术的发展，其应用领域也在不断扩大。现在医药工业、临床医学 、环境科学、食品科学、化学化工等领域均有广泛的应用。1.1 医药工业中应用 薄层色谱技术广泛应用于中草药品种鉴别和成分分析、中成药鉴别和质量标准研究、合成药物的定性鉴别、纯度检查、稳定性考察和药物代谢以及合成工艺监控分析、生化和抗生素研究等方面。1.2 临床医学应用 薄层色谱法用于生物样品与毒物分析。分析的生物样品多为血清，血浆或尿液等 ，用来进行药物生物利用度的分析，检测临床用药的血药浓度，以利于诊断临床疾病等。毒物分析的内容比较广泛，包括植物毒素、真菌毒素、兴奋剂、药物中毒、走私毒品、农药以及尸检刑侦破案等方面的样品分析。1.3 环境科学中应用 薄层色谱可以用来进行环境有害物质的分析。主要包括农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃定等。1.4 食品科学中应用 薄层色谱法还应用于分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分也用于食品添加剂如色素、防腐剂等，以及某些真菌毒素如黄曲霉毒素的分析。1.5化学化工中的应用 薄层色谱在化学化工方面也有很多应用，例如无机及金属有机化合物分析、染料及化妆品分析、石油和煤分析、手性化合物分离和化工及高分子材料分析。还适用于对高分子材料的助剂、填料等进行分析。2. 薄层色谱技术的深化 直至2000年，我国薄层色谱鉴别基本是以手工点样、实验室自制薄层板为基础的较为粗放的操作进行试验，由于硅胶材料的质量不高和手工操作的个体差异较大，致使色谱结果不尽人意，分离度、重现性均难以达到满意的效果。国外，尤其是欧洲国家在薄层色谱技术及相应的仪器开发上逐步有了很大发展，20世纪90年代已经达到单元操作计算机自动化，高质量商品预制薄层板常规板与高效板代替了自制薄层板，进入一个高层次的仪器和微机化的阶段。随着技术和仪器的引进，我国在薄层色谱技术方面迅猛发展，高效薄层板及薄层色谱仪器已普遍使用。这就要求我们将教学内容更新和实验课中操作方法改进。 高效薄层色谱法HPTLC是近年来迅速发展的一种高效、快速、操作简便、结果准确、灵敏度高和重现性好的薄层色谱新技术。高效薄层色谱采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性，弥补了常规的普通薄层色谱TLC存在的展开时间长、展开剂体积需求大和分离结果差等缺点。薄层色谱扫描仪由单板机控制和配备积分仪的薄层扫描仪，转型为以工作站控制的台式计算机自动控制操作的薄层扫描仪。使用薄层色谱扫描仪进行定量检测有吸收测定法、荧光测定法和荧光猝灭法。对在可见及紫外光区有吸收的化合物可用钨灯和氘灯在 190-800nm范围进行透射和反射吸收法测定；化合物本身或者经过色谱前和色谱后衍生化生成对紫外有吸收并能放出更长波长的化合物适用荧光法测量，荧光法灵敏度高，最低可测至pg级；本身无颜色、又无特征紫外吸收或荧光，并且不易衍生的化合物，可使用含有荧光剂的薄层板，采用荧光猝灭法测量。此外，自动铺板仪、电动喷雾器、自动点样仪、薄层色谱展开仪、薄层色谱成像仪等的使用，使薄层色谱法逐步实现了仪器化。3. 薄层色谱的规范化操作在过去的实验教材中，很多属于经验性操作，薄层色谱的结果难以重现。如自制薄层板，制备时硅胶中加入羧甲基纤维素钠水溶液的量，以研棒匀浆下滴判断；倾注薄板上，以手指颠动至均匀；点样不定量，以点的直径约为2 mm为标准；在电炉上加热显色，直至斑点清晰等。另外，在薄层板下沿“刻痕 ”、“标记对展开有很大影响；摇动展开缸混合展开剂很难将不同极性试剂混匀，混合不均匀和有分层的展开剂，会造成层析的完全失败。为了得到有良好的分离度和重现性的色谱，在实验操作中一定要强调规范化。如薄层板最好是购置高效或普通薄层板。即使自制，也应将硅胶和水的比例、铺板的厚度固定，使用铺板器铺板。即使用于鉴别，样品的制备应量化操作并进行预处理，以减少杂质的干扰，提高色谱的清晰度，提高可鉴别性。在薄层板上定量点样，则样品得到的色谱不仅以回答“有没有 ”和“是不是”的问题，还可以粗略地进行量化评价，在一定程度上提供“优劣”的信息。点样最好采用半自动或自动喷雾点样仪，若用手工定量毛细管接触式点样，操作需要细致小心，不可划破薄层板，原点尽量减少溶剂扩散现象。在其他条件相同的情况下，温度和湿度对色谱质量有显著影响。为了不同实验室之间及不同季节均可重现试验结果，应尽可能在温度和相对湿度可控 的条件下展开为宜，至少记录下试验时实际的温度和湿度。 在实验课中，每一步骤都要强调规范化操作，是学生在技术层面得到更明显的提高。为了弥补教材的滞后性，在理论课中要不断的将薄层色谱新发展，新技术补充进课堂 。不但让学生掌握现有知识，还要对今后的发展具有前瞻性。 袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁