细胞工程第三节植物细胞浮培养ppt课件.ppt

,1、定义：液体培养基中能保持良好分散状态的细胞和小细团的培养。2、优点：（1）充分吸收营养（2）细胞增殖快（3）可进行大规模的培养,第三节植物细胞悬浮培养,1、定义：液体培养基中能保持良好分散状态的细胞和小细团的培养。2、优点：（1）充分吸收营养（2）细胞增殖快（3）细胞的相对大小均一(4)可进行大规模的培养,1,一、细胞悬浮培养原理,植物离体培养可产生愈伤组织,将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后，可形成分散悬浮培养物。,2,细胞的悬浮培养示意图,3,（一）悬浮培养Suspensionculture,特点,细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。,必须指出,悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。,4,（二）植物细胞悬浮培养的特性,1植物细胞较微生物细胞大得多，有纤维素细胞壁细胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；2培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染，需用抗生素；3细胞生长的中期及对数期易凝聚为直径达350m一400m的团块，悬浮培养较难；,5,4培养时需供氧，培养液粘度大：5具有群体效应；6因为有细胞壁,培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7细胞培养过程有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内浓度；8悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（2500050000个/ML）。,6,起始悬浮液的制备,7,二、培养方法,植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为：分批式流加式半连续式连续式和灌注式五种。,8,1、分批培养/成批培养（Batchculture）,含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。,9,分批式培养（batchculture）,该方式大多采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。,10,该方式的特点,培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。培养基体积固定，不添加任何营养成分。直观反映细胞生长代谢的过程。培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S增长。反应器系统属于封闭式，必须适当搅拌控制温度pH值和通气。,11,2流加式培养（feedingculture）,流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/21/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度。整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩纯化目标蛋白。,12,（1）流加培养特点：,流加培养根据情况流加浓缩的营养培养基，流加的速率与消耗的速率相同，保证合理的培养环境与较低的代谢产物抑制水平。培养过程以低稀释率流加，细胞在培养系统中停留时间较长，总细胞密度较高，产物浓度较高。流加培养细胞培养基的设计和培养条件与环境优化，是整个培养工艺中的主要内容。在工业化生产，悬浮流加培养工艺参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，可采用工艺参数的直接放大。,13,（2）流加工艺中的营养成分主要分为三大类,葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质。谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要的氮源物质。氨基酸维生素及其他：主要包括营养必需氨基酸营养非必需氨基酸一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分如胆碱生长刺激因子。,14,（3）流加式培养分为两种类型,单一补料分批式培养反复补料分批式培养。,15,单一补料分批式培养,单一补料分批式培养是在培养开始时投入一定量的基础培养液，培养到一定时期，开始连续补加浓缩营养物质，直到培养液体积达到生物反应器的最大操作容积，停止补加，最后将细胞培养液一次全部放出。该操作方式受到反应器操作容积的限制，培养周期只能控制在较短的时间内。,16,反复补料分批式培养,反复补料分批式培养是在单一补料分批式操作的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分培养液，使培养液体积始终不超过反应器的最大操作容积，从而在理论上可以延长培养周期，直至培养效率下降，才将培养液全部放出。,17,3半连续式培养（semi-continuousculture）,半连续式培养即每隔一定时间（如1-2天）收获部分培养物，再加人等量培养基的方法。又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统的悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。,18,半连续式特点,（1）培养物的体积逐步增加；（2）可进行多次收获；（3）细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。（4）该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。,19,4连续式培养（continuousculture）,连续培养方法，即培养若干天后连续收获细胞培养物的同时不断补充培养液的方法。连续式培养是一种常见的悬浮培养模式。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。,20,连续培养（Continuousculture）示意图,加入培养基,排出培养基及其培养物,二者体积相等,21,连续式培养的特点,细胞维持持续指数增长；产物体积不断增长；可控制衰退期与下降期。,22,连续培养意义：植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速物质浓度对细胞生长的影响）；次生物质的大量生产。,23,5灌流式培养（perfusionculture）,灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。,24,灌流式培养使用的生物反应器,灌流式培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。,25,另一种生物反应器,中空纤维生物反应器也是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性植物细胞的生产。总之：这几个系统较明显地提高了细胞的生产率，可收获快速生长的细胞。,26,三、悬浮系的建立与继代培养,(一)悬浮系的制备将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经过摇床不断振动，使细胞分散。通常适于愈伤组织生长的液体培养基也适用于同种植物细胞的悬浮培养。有时需要调节激素的浓度。,27,一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件,1悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。2均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。3细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,28,(二)继代培养,继代培养亦称“传代培养”。将培养的植物细胞组织或器官乃至植物小植株从原来的培养基上转移到一种新鲜的培养基上继续培养的过程称为继代培养。它是培养物连续传代的一种方法，每转移培养一次即称为一代。因此按转移培养的次数确定继代培养的代数。,29,1.继代的方法和最佳时期,继代方法：用注射器或移管吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。,30,31,最佳继代时期：了解细胞数目增长变化S形曲线后，选择对数生长期和直线生长期！,32,2.细胞生长曲线,在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线,33,5,S形曲线,34,滞后期,对数生长期,直线生长期,缓慢期,静止期,1,2,3,4,5,35,细胞生长各个时期的特点：,滞后期（延迟期）,细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关,对数生长期,细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变,直线生长期,细胞生长和发育最明显的时期,36,细胞生长各个时期的特点：,缓慢期,生长逐渐缓慢：培养液消耗尽，有毒代谢物质增多，氧气减少,静止期,生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。,37,生长速率的计算,生长速率按下列公式计算：P=（lnx-lnX0）/tP为生长速率X为t时间的细胞密度，X0为起始细胞密度,38,讨论（1）滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。（2）加入条件培养基可以缩短滞后期。条件培养基：曾培养过一段时间组织或细胞的培养基。,39,（3）缩短两次继代时间间隔，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长期。（4）如果使处在静止期的细胞悬浮液保持时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。,40,（5）观察细胞染色体,在对数生长期,18chromosomes,41,操作注意事项：对悬浮培养细胞继代时，进液口的孔径要小，只能通过单细胞或小细胞团（2-4细胞），使用吸管或注射器。继代前，培养容器静置短时间，大细胞团沉降，再吸上层悬浮液。依此，多次，可建立良好的细胞悬浮培养物。,42,四悬浮培养细胞的同步化,细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态，,43,常用的处理方法,（一）物理方法1分选法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。2冷处理法。低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度。,44,（二）化学方法,1饥饿法2抑制剂法3有丝分裂阻抑法,45,五细胞增殖的测定,（一）细胞计数法取一定体积的细胞悬液，加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3），置70水浴处理15min。冷却后，用移液管重复吹打细胞悬液，以使细胞充分分散，混匀后，取一滴悬液置入血细胞计数板上计数。或用5铬酸或0.25果胶酶使悬浮细胞团分散用血球计数板进行。,46,（二）细胞密实体积（PCV）,将体积已知均匀分散的悬浮液放入一个15ml的离心管中，2000转下离心，用每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。,47,（三）细胞生物量计算法,1鲜重法（freshweighmethod）直接称量法：在转代培养的不同时间，取一定体积的悬浮细胞培养物，真空抽虑或离心收集后，称量细胞的鲜重。制作细胞鲜重生长曲线法：.为了解悬浮培养细胞的生长动态，可用以下方法绘制生长曲线图，以鲜重为纵座标，以培养时间为横座标，绘制鲜重增长曲线。,48,2干重法（dryweighmethod）,直接称量法：可在称量鲜重之后，将细胞进行烘干，60干燥12小时，再称量干重。以每毫升培养物或106个细胞的重量表示。绘制细胞干重生长曲线法：以干重为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制细胞干重生长曲线。,49,（四）植板率,用平板法培养单细胞或原生质体时，常用植板率来表示能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分率。植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺与培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或parafilm封口膜将培养皿封严以防污染。在25黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的愈伤组织。,50,植板率评估,它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。植板率(%)=（每个平板上形成细胞团的数目/每个平板上接种的细胞的数目）100。,51,植板效率（或植板率）：已形成细胞团的百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有多少个能长出细胞团）。每个平板上形成的细胞团数植板效率=该平板上接种的细胞数,52,（五）细胞大小测量,常用显微尺测量在显微镜下所观察的细胞长度来表示，也有同时测量长度和宽度的。测量长度时，通常用目镜测微尺与镜台测微尺配合使用。,53,六、培养细胞活力的测定,相差显微术法TTC法（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）FDA法（荧光素双醋酸酯法）伊凡蓝法,观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、核存在表明有活力；,在活细胞中，TTC被还原成红色甲鐟，提取分光光度计检测。,活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞,54,FDA法的原理,FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以自由出入细胞膜。在活