血液学血细胞化学染色ppt课件

.,第三章细胞化学染色技术,.,学习目标,1.掌握：细胞化学染色的基本步骤；铁染色、过氧化物酶染色、酯酶染色、过碘酸-希夫染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色的正常血细胞染色反应和临床意义。2.熟悉：细胞化学染色的概念和临床应用。3.了解：细胞化学染色的原理和影响因素。,.,第一节概述,一、概念细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以细胞形态学为基础，结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学成分(酶类/脂类/糖类/铁/蛋白质/核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。,.,要求：,血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。,.,二、必要性,从形态学观察，存在较多的主观性；有些原始细胞形态较相似，难以鉴别；结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。,.,三、临床应用,1.辅助判断急性白血病的细胞类型2.辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断3.观察疾病的疗效和预后4.疾病发病机制的探讨,.,白血病的诊断：MICM分型M：morphologyI：immunologyC：cytogeniticsM：molecularbiology,形态学分型：进行初步的诊断免疫学分型：明确细胞种类细胞遗传学分型：与疾病预后有关分子生物学分型：提高到分子水平,.,四、基本步骤,1.固定（1）物理法：干燥、火焰（2）化学法：A、蒸气固定：甲醛B、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇、丙酮。,.,2.显示：有色沉淀反应,（1）偶氮偶联法：酯酶染色（2）联苯胺法：POX（3）普鲁士蓝反应：Fe（4）希夫反应：PAS（5）金属沉淀法：NAP（6）物理显色法：SBB,.,3.复染：使各种细胞能显示出来,铁染色-中性红、伊红PAS-甲基绿核：中性红、甲基绿、沙黄等。浆：伊红、刚果红、光绿等。,.,五、研究对象外周血和骨髓新鲜涂片单个细胞中的化学物质：酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等,.,第二节常用细胞化学染色技术,铁染色过氧化物酶染色苏丹黑B染色酯酶染色过碘酸-希夫反应中性粒细胞碱性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色,.,一、铁染色（ferricstain）,.,亚铁氰化钾,亚铁氰化铁(蓝色沉淀在含Fe部位),铁,酸性环境,普鲁士蓝反应,骨髓小粒中的含Fe血黄素（细胞外铁）骨髓中贮存铁幼红细胞内的Fe（细胞内铁）,原理,.,二、结果判断,1.细胞外铁(骨髓小粒含铁血黄素),铁颗粒、铁小珠、铁团块,.,细胞外铁(低倍镜观察)（）：无颗粒（）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠（）：有较多的铁颗粒或铁小珠（）：有很多的铁颗粒、铁小珠和少数铁小块（）：有极多铁颗粒、小珠和很多铁小块，密集成堆。,.,2.细胞内铁(中晚幼红细胞，油镜观察),（1）分级(按铁颗粒数量的多少及大小)细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清。粗大颗粒：很容易看清的颗粒。（2）阳性率观察100个中晚幼红细胞，计算出铁粒幼红细胞的百分比。,.,【结果判断】幼红细胞核染色为鲜红色,铁粒呈蓝绿色。,.,细胞内铁(油镜观察幼红细胞),型：12个小铁颗粒；型：35个小铁颗粒；型：610个小铁颗粒或14个大颗粒；型：10个以上小铁颗粒或5个以上大颗粒。,.,环形铁粒幼红细胞(ringedsideroblast)幼红细胞胞质内铁颗粒6个，围绕核周2/3以上者。,铁粒幼红细胞(sideroblast)：胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。,铁粒红细胞(siderocyte)：胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。,.,绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞,.,1.细胞外铁：（+）（+）2.细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约1244%，III型（I型为主），无型、型、环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞。,三、参考范围,.,四、临床意义,铁染色是评估铁缺乏最实用的方法，是反映储存铁的金标准，是临床应用最广泛的细胞化学染色之一。,.,1.缺铁性贫血：外铁（），内铁15%。4.非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、白血病等，内外铁正常或增多。5.感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等：外铁增多。,.,五、应用评价,铁染色是临床常用的一种细胞化学染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但是反映机体储存铁的金标准。外铁：反映骨髓中铁的储存量；内铁：反映骨髓中可利用的铁量。,.,二、过氧化物酶染色（peroxidase,POX）,.,一、原理,粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶(POX)，它可分解H2O2释放出新生态的氧，后者氧化二氨基联苯胺，形成金黄色不溶性沉淀，定位于胞质内酶所在的活性部位。二甲基联苯胺法（DAB）原理,.,POX,新生态氧O,过氧化氢（基质中）,四甲基联苯胺（无色）,联苯胺蓝（蓝色）,亚硝基铁氰化钠,蓝色颗粒（浆内酶部位）,粒、单核细胞胞浆,【原理】,.,二、ICSH推荐的三种方法二氨基联苯胺法（DBA）二盐酸联苯胺法过氧化物酶氨基-甲基卡巴唑染色法,.,三、结果判断,在细胞质内出现金黄色颗粒为阳性反应。（二氨基联苯胺法）,.,二氨基联苯胺法,.,二盐酸联苯胺法,.,二盐酸联苯胺法,.,【结果判断】-、+、+、+、+弱阳性颗粒小，分布稀疏阳性颗粒稍粗，分布较密集强阳性颗粒粗大，密布于整个胞浆,.,POX结果判断,细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。（）无颗粒沉着；（a）（）颗粒细小，分布稀疏；（b）（+）颗粒较粗，局灶分布；（c）（+）颗粒粗大，分布较密，占胞质1/22/3；（d）（+）颗粒粗大，呈团块分布；（e）（+）全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核（f）。,.,【正常血细胞染色反应】1.粒细胞系统POX主要存在于粒系细胞中。分化差的原粒细胞阴性;分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞各阶段均呈阳性，阳性反应程度随细胞的成熟逐渐增强。中性分叶核粒细胞：强阳性嗜酸粒细胞：阳性最强嗜碱粒细胞：（）,.,2.单核细胞系统阴性或弱阳性3.淋巴细胞系统红细胞系统巨核细胞系统阴性浆细胞组织细胞,.,.,.,.,.,四、临床意义,鉴别急性白血病的类型首选（1）急淋和急性髓细胞系的鉴别：急淋：（），阳性率3%；急单：弱阳性；急粒：阳性（+）。,.,2.单核细胞系统：（）或弱（+），阳性颗粒少而细小。3.其它系统细胞：淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核细胞系统、浆细胞、组织细胞（）。,.,【临床评价】,急性髓细胞白血病急性淋巴细胞白血病,鉴别,.,1.急性髓细胞白血病（1）急性粒细胞白血病阳性反应（2）急性单核细胞白血病弱阳性反应,.,2.急性淋巴细胞白血病阴性反应或阳性率3%(残留原粒细胞),.,ALL,.,ALL,.,原粒阴性,.,原粒弱阳性,.,原粒阳性,.,早幼粒强阳性,.,一、原理,苏丹黑B是一种脂溶性重氮染料，可溶解细胞内含脂结构(中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇)，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色(粒细胞：丰富；单核细胞：少量)。,三、苏丹黑B染色（SudanblackB，SBB）,.,正常血细胞的染色反应,与POX染色基本一致临床意义与POX染色相似,.,二、SBB与POX区别：,1.POX特异性高于SBB，而敏感性低于SBB；2.POX染色要求涂片新鲜，保持酶活性，SBB染色可用陈旧涂片。,.,.,.,1.特异性酯酶（specificesterase）主要存在于粒细胞，又称“粒细胞酯酶”氯乙酸AS-D萘酚酯酶（NAS-DCE）。,一、分类,四、酯酶染色,.,2.非特异性酯酶(nonspecificesterase)单核、组织细胞中含量较多，粒细胞、淋巴细胞中含量少，且氟化钠抑制单核细胞中的非特异性酯酶，而不抑制粒细胞、淋巴细胞及其他细胞。,.,醋酸AS-D奈酚酯酶：NAS-DAE-醋酸奈酚酯酶：-NAE-丁酸奈酚酯酶：-NBE酸性-醋酸奈酚酯酶：ANAE(-NBE敏感性不如NAS-DAE但特异性较之强),.,（一）特异性脂酶染色,1.氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色NaphtholAS-Dchloroacetateesterase,.,1.原理,氯乙酸AS-D萘酚AS-D萘酚不溶性的有色(红)沉淀。NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”,NAS-DCE,重氮盐(坚牢蓝紫酱),.,氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色,.,2.正常血细胞的染色反应,粒系(酶活性不随细胞成熟而增强)原粒（）或（+）早幼粒成熟中性粒细胞（+）嗜酸性粒细胞（）或弱（+）嗜碱性粒细胞（+）,.,单核细胞系统：（）肥大细胞：（+）淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、巨核细胞、血小板：（）,.,3.临床意义,主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型：急性粒细胞白血病：（+）急性早幼粒细胞白血病：强（+）急性单核细胞白血病：（）急粒-单：粒细胞（+）单核细胞（）急性巨核细胞性白血病：（）急性淋巴细胞白血病：（）,.,原理：非特异性脂酶在相应的pH环境中，将基质液中相应底物水解，产生含萘酚的物质，后者与重氮盐发生偶联反应，形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,（二）非特异性脂酶染色,.,根据pH值的不同分为：酸性：酸性-醋酸萘酚酯酶染色(ANAE)中性：-醋酸萘酚酯酶染色(-NAE)醋酸AS-D萘酚酯酶染色(NAS-DAE)碱性：-丁酸萘酚酯酶染色(-NBE),.,.,1.-醋酸萘酚酯酶染色（-naphtholacetateesterase，-NAE）,.,-醋酸萘酚酯酶（细胞内）,-醋酸萘酚（基质液中）,-萘酚,重氮盐（坚牢蓝B）,胞浆不溶性灰黑色或棕黑色沉淀,水解,【原理】,.,【结果判断】胞浆内有灰黑色或棕黑色弥散性颗粒状沉淀为阳性。,.,-醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色),.,-醋酸萘酚酯酶染色,a:单核b:BPCc:巨核d:LC(+)e:幼红(-),.,氟化钠抑制试验在基质液中加入适量NaF,其余染色方法同上。两种方法染色后用油镜计数100或200个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率或阳性积分。,.,氟化钠抑制率=,抑制前阳性率或阳性积分-抑制后阳性率或阳性积分,抑制前阳性率或阳性积分,100%,.,.,A图：急性单核细胞白血病-NAE染色原始、幼稚单核细胞多呈强阳性,B图：急性单核细胞白血病-NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）,A,B,.,【临床评价】,急单急粒急性早幼粒急粒单急淋-NAE+或-或+阳性-+弱+NaF被抑制不被不被抑制部分被抑制抑制部分未被抑制,主要用于鉴别急性白血病类型,.,2.临床意义,辅助鉴别急性白血病细胞类型急单：单核细胞阳性，能被NaF抑制。急粒：粒细胞弱阳性，不被NaF抑制。,.,M3：强阳性，不能被NaF抑制。M4：部分阳性细胞能被NaF抑制，部分阳性细胞不能被NaF抑制。ALL：原幼淋阴性或阳性，不能被NaF抑制。,.,【正常血细胞染色反应】,1.单核细胞系统原始单核细胞分化差阴性分化好阳性幼稚及成熟单核细胞阳性,被氟化钠抑制,.,2.粒细胞系统原粒细胞阴性或弱阳性以下阶段为弱阳性3.淋巴细胞系统多数阴性，少数弱阳性,不被氟化钠抑制,.,2.-丁酸奈酚酯酶染色-NBE,原理：血细胞中-NBE在碱性条件下，基质液中的-丁酸奈酚水解，产生-奈酚，后者与坚牢酱紫GBC偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内。,.,-NBE染色反应,1.粒系：各期（-）2.单核系：分化差的原单（-）；分化好的原单（+）幼单成熟单核（+），可被NaF抑制3.淋巴系：TC、非T非B（+）BC（+）4.其他细胞：巨核、有核红细胞、浆细胞（-）或弱（+）组织细胞(+),不被NaF抑制,.,3.酸性-醋酸奈酚酯酶染色ANAE,原理：血细胞中的酸性-醋酸奈酚酯酶（ANAE）在pH弱酸性（pH5.8）的条件下，可水解基质液中的-醋酸奈酚，产生-奈酚，进而与重氮盐六偶氮付品红形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。,.,酸性-醋酸萘酚酯酶染色（弥漫性棕红色）-M5,.,ANAE染色反应,1.单核系：强（+）可被NaF抑制2.淋巴系：TC（+）BC（-）3.其他细胞：粒系（-）或弱（+）不被NaF抑制红系、巨核系（-）,.,4.酯酶双染色,在同一张涂片上进行两种酯酶染色,特异性酯酶+非特异性酯酶,对诊断急性粒-单细胞白血病有独特价值,-NAE与NAS-DCE红色(单)-NBE与NAS-DCE兰色(粒),.,骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应。,.,NAS-DCE：M1弱(+)/M2(+)/M3强(+)，M5/ALL()；-NBE：M5(+)NaF抑制，M1/M2/M3/ALL()；-NAE/NAS-DAE：M5强(+)NaF抑制M3强(+)/M1M2a/ALL(+)NaF不抑制。,.,五、过碘酸-希夫反应(糖原染色)（periodicacid-Schiffreaction，PAS）,.,双醛基,过碘酸,希夫试剂中的无色品红,紫红色化合物(附于含多糖类的胞浆内),乙二醇基(多糖类物质含有),氧化,【原理】,.,过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基的多糖类物质(糖原、糖蛋白、糖脂、粘多糖等)氧化，形成双醛基。醛基与Schiffs液中的无色品红结合，使无色品红变成紫红色化合物，定位于含多糖类的细胞内。,一、原理,.,【结果判断】,阳性胞浆内红色阳性物呈弥散状、颗粒状或块状。阴性胞浆内无色或无颗粒,核淡绿。,.,.,.,1.粒细胞系统：（阳性逐渐增强）原始粒C（）或（+）早幼粒C成熟中性粒C（+）：细颗粒均匀红色嗜酸粒C：颗粒不着色，胞质呈红色。嗜碱粒C：颗粒阳性，胞质不着色。,二、正常血细胞的染色反应,.,2.单核细胞系统：分化差（）其他（+），粗颗粒状。3.淋巴细胞系统：多数（）少数（+），粗颗粒或块状。4.红细胞系统：（），病理情况可（+）。5.巨核细胞系统：（+），颗粒状或块状。6.其它细胞：浆细胞（），巨噬细胞（+）,.,a粒细胞、b巨核细胞、c单核细胞、d幼红细胞,.,三、结果判断,1.粒细胞系统：红色、弥散状。,各种细胞阳性反应强弱不同,2.淋巴细胞系统：粗颗粒状、小块状、大块状红色。,.,1、+2、+3、+4、+5、,.,3.红细胞系统：均匀红色或块状,4.单核细胞系统：粗颗粒状,5.巨核细胞和血小板：颗粒状、块状。,.,1.巨核细胞和血小板阳性,.,1.帮助鉴别巨幼细胞性贫血和骨髓增生异常综合征、红白血病:前者（），后两者（+）。,四、临床意义,.,.,急性淋巴细胞白血病PAS染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性,.,109,急淋PAS阳性细胞,.,110,PAS阳性的幼红细胞,.,2.帮助鉴别急性白血病的细胞类型：急淋：（+）呈粗颗粒状或块状。急粒：（+）细颗粒状或均匀红色。急单：（+）细颗粒状，均匀分布，有时胞质边缘颗粒较粗大。,.,3.其他细胞：骨髓转移性腺癌细胞细胞呈强阳性霍奇金淋巴瘤RS细胞多呈阴性或弱阳性戈谢细胞呈强阳性尼曼-皮克细胞多呈阴性或弱阳性,.,CLL,ALL,.,六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（neutrophilicalkalinephosphatase，NAP）,.,磷酸萘酚钠（基质中）,中性粒细胞胞浆中NAP,磷酸钠,-萘酚,重氮盐（坚牢蓝盐RR）,紫黑色偶氮染料（胞浆中）,水解,【原理】Kaplow偶氮偶联法,.,【结果判断】胞浆中有紫黑色颗粒为阳性(+）,.,【正常血细胞染色反应】,中性成熟粒细胞阳性反应NAP主要存在于成熟的中性粒细胞胞质中。严重的化脓性感染时，晚幼阶段粒细胞也可见有阳性反应。2.其他细胞基本呈阴性反应,.,.,NAP染色反应强度标准：（）：胞质中无颗粒；（）：胞质含少量颗粒，约占1/4；（）：胞质含中等量颗粒，约占1/2；（）：胞质含较多颗粒，约占3/4；（）：胞质充满颗粒，无空隙。,.,2.NAP积分值计数100个成熟中性粒细胞（杆状和分叶）,分别记录其分级情况：,.,(-)0分(+)1分(+)2分(+)3分(+)4分阳性率全部阳性反应细胞之和积分值各种阳性程度细胞的分值之和,.,NAP染色结果报告包括阳性率和积分值。阳性率：指计数100个中性成熟粒细胞，其阳性细胞的数量即为阳性率；积分值：指计数100个中性成熟粒细胞，不同阳性程度细胞数量乘以其阳性程度之和即为积分值，其计算公式为：积分值=()数量1+()数量2+()数量3+()数量4。,2.NAP染色结果报告：,.,例：,4分占20%420=80分3分占40%340=120分2分占18%218=36分1分占10%110=10分0分占12%012=0分阳性率88%积分=246分,.,.,0级0胞浆呈原色，无颗粒。级+胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%50%。,级+胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%75%。,.,级+胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%100%。,级+胞浆充满深黑色致密的团块状沉淀，甚至遮盖胞核，中到大颗粒占胞浆面积的l00%。,.,.,3.参考范围：中性粒细胞NAP阳性率：40%NAP积分为：30130分,.,【临床评价】（1）细菌性感染与病毒性感染（尤其是化脓性感染）明显增加无明显变化,.,四、临床意义,1.生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。,2.病理性变化：(1)NAP：细菌性感染、慢粒(加、急)、急淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、骨纤、真红、再障、原发性血小板增多症、使用糖皮质激素等。,.,3.疾病的鉴别：,(1)类白与慢粒:前者后者(2)慢粒慢性期与慢性中性粒细胞白血病：前者后者(3)细菌性感染与病毒性感染/寄生虫感染：前者后两者正常或,(2)NAP：慢粒(慢)、PNH、MDS、恶组等。,.,(6)恶组与反应性组织细胞增多症：前者后者常(7)急性白血病类型：急性髓细胞急淋,(4)慢粒病情观察：(5)再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿：前者后者,.,CML,类白,.,(2）类白血病反应与慢性粒细胞白血病明显增加明显下降且常为零分，缓解时又上升到正常,.,五、应用评价,NAP染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐Kaplow萘酚AS-BI磷酸钠法和Tomonaga萘酚AS-MX磷酸钠法。钙-钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚AS-BI磷酸钠法最为广泛使用，利于评定NAP活性强度的分级。常用重氮盐有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等，不同偶联有不同的灵敏度。,.,七、酸性磷酸酶染色(acidphosphatase，ACP),一、原理,1.Gomori硫化铅法,.,棕黑色,pH5.0,.,2.偶氮偶联法(常用)六偶氮付品红棕红色沉淀,磷酸萘酚AS-BI萘酚AS-BI棕红色沉淀,ACP,Ph5.0,重氮盐,.,.,3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一组同工酶）,两张相同标本涂片+两份基质液(加L-酒石酸，不加L-酒石酸),ACP染色,耐L-酒石酸两份（+）,不耐L-酒石酸不加L-酒石酸（+）加L-酒石酸（）,.,二、正常血细胞染色反应,粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性反应。,.,三、临床评价,1.诊断多毛细胞白血病多毛细胞白血病：（+），不被L-酒石酸抑制。慢淋和恶性淋巴瘤细胞:（+），被L-酒石酸抑制。,.,多毛细胞白血病,慢性淋巴细胞白血病,.,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,酸性磷酸酶染色,多毛细胞白血病,.,多毛细胞白血病抗L-酒石酸ACP阳性,.,2.鉴别戈谢(Gaucher)细胞和尼曼-匹克(Niemann-Picks)细胞：前者（+）后者（）3.鉴别T淋巴细胞和B淋巴细胞：前者（+）后者（）,.,Gaucherscell,.,八.细胞化学染色综合分析,.,四种常见急性白血病的细胞化学染色结果,项目M3M1/M2M5ALL,POX强阳性阳性/阴性弱阳性/阴性阴性NAS-DCE强阳性阳性/阴性多阴性