第七章 分光光度法

.,第七章,分光光度法,.,分光光度法是一种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种分析方法，是生命科学中最常用的分析技术之一。包括：(1)可见分光光度法(2)紫外-可见分光光度法(主要)(3)红外光谱法等,分光光度法(AbsorptionPhotometry),.,特点,(一)灵敏度高,分光光度法测定物质的浓度下限(最低浓度)一般可达110-3%的微量组分。对固体试样一般可测到10-410-5%的痕量组分。如果对被测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级。,.,一般分光光度法的相对误差为25%，若使用精密仪器，相对误差可降至12%，其准确度虽不如滴定分析法及重量法，但对微量成分来说，还是比较满意的，因为在这种情况下，滴定分析法和重量法准确度更差，甚至无法进行测定。,(二)准确度较高,.,(三)操作简便，测定速度快,(四)应用广泛,几乎所有的无机离子和有机化合物都可直接或间接地用分光光度法进行测定。不仅用于定量分析，也可用于某些有机物的定性分析，还可用于某些物理化学常数及络合物组成的测定。,.,物质对光的选择性吸收,第一节,.,一、光的基本性质,1.光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。其波长、频率与速度之间的关系为：普朗克方程h：普朗克常数，其值为6.6310-34Js普朗克方程表示光的波动性与粒子性之间的关系。波长越长，能量越低；波长越短，能量越高。,.,2.单色光和复合光,(1)单色光：指波长处于某一范围的光。(2)复合光：由不同单色光组成的光。例如：阳光和白炽灯发出的光均为复合光,.,3.电磁波谱,表10-1电磁波谱(1m=106m=109nm=1010),.,4.可见光和互补光,(1)可见光:指人的眼睛所能感觉到的光，波长范围为(400750nm)的电磁波。(2)互补光:将两中适当颜色的光按一定的强度比例混合，如果能形成白光，这两种光称为互补光。,.,图10-1光的互补色示意图(/nm),.,二、物质对光的选择性吸收,如果我们把具有不同颜色的各种物体放置在黑暗处，则什么颜色也看不到。可见物质呈现的颜色与光有着密切的关系，一种物质呈现何种颜色，是与光的组成和物质本身的结构有关的。,.,(一)物质对光产生选择性吸收的原因,当光通过透明物体时，光子是否被物质吸收。取决于：光子所具有的能量物质的内部结构,由于不同物质的分子其结构和组成不同，它们所具有的特征能级也不同，故能级差也不同。物质对光的吸收具有选择性。,.,在可见光区，不同波长的光具有不同的颜色。当一束阳光(白光)通过棱镜后就色散成红、橙、黄、绿等颜色的光，这些光具有不同的波长。所以不同颜色光，其波长不同，物质的颜色正是由于他们对不同波长的光具有选择性吸收而产生的。当一束白光通过某一物质或溶液时，由于物质对光的选择性吸收，某些波长的光被吸收，另一些波长的光则不被吸收而透过溶液。,(二)物质的颜色与光吸收的关系,.,溶液的颜色由透过光的波长所决定,(1)如果物质把各种波长的光完全都吸收，则呈现黑色；(2)如果完全反射，则呈现白色；(3)如果透过所有的光，则为无色透明溶液；(4)如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰色；(5)如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么，这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来决定。,.,例如：CuSO4溶液,实验证明：CuSO4溶液浓度越高，对黄色光的吸收越多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。,.,1.用不同波长(400-720nm)的光，照射某一吸光物质的溶液；2.测吸光度(A)3.以A作图，得一曲线直观地表示出物质对光的吸收特征。,（三）吸收曲线,.,图10-2KMnO4溶液的吸收曲线,(cKMnO4：abcs，两式相减得：A=Ax-As=b(cx-cs)=bC即：用cs作参比调零(T=100%)，测得cx吸光度是试液与参比溶液的吸光度差值。由上式可知：两溶液吸光度之差A与两溶液浓度之差c成正比。,.,制作Ac标准曲线从中查得c即可求出其浓度：cx=cs+c,.,3.提高测量准确度的原理,示差法相对于普通光度法来说，提高测量准确度的原因是扩展了读数标尺。,在普通光度法中，以试剂空白为参比，测得透射比分别为：csTs=10%cxTx=5%,在示差法中，以cs为参比调节透射比为100%，这相当于将仪器读数标尺扩展了10倍，这时测得cx的示差透射比:Tf=Tx/Ts=50%。,.,4.示差法仪器构造的要求,从仪器构造上讲，示差光度法需要一个发射强度较大的光源，才能将高浓度参比溶液的A调至零。必须采用专门设计的示差光度计，这就使其应用受到了一定限制。,.,例题：,用一般光度法测0.0010mol.L-1锌标液和含锌的试液，分别测得As=0.700和Ax=1.00，两溶液的透光度相差多少？若用0.0010mol.L-1锌标液作参比，试液的A为多少？示差光度法与一般光度法相比，读数标尺放大了多少倍？,.,解：,.,(二)多组分的同时测定,同时测定一种试样中的多种组分的基础是吸光度具有加合性，即总吸光度为各个组分吸光度的总和。,.,二、络合物组成和酸碱离解常数的测定,(一)络合物组成的测定,.,1.摩尔比法,在一定条件下，假设(M)金属离子与络合剂发生显色反应：M+nR=MRn为了测络合比n，可固定cM，改变cR测定方法：固定cM，改变cR配一系列cR/cM不同的溶液在max处，测A以AcR/cM作曲线,.,曲线OB段代表显色反应尚未进行完全的阶段，此时cR/cMn，故A随cR而增加。理论上，当M与R按化学反应剂量关系定量完全作用时，A应达到曲线最高点E所对应的值。继续增加cR，由于M已全部生成了相应的络合物，A基本保持不变，即CD直线显然，曲线的转折点E，所对应的cR/cM=n找E点：由BC弧线可画切线外推找交点，即为E点。,图10-10摩尔比法,适应范围：此法适用于离解度较小，配位比高的配合物组成的测定，当离解度较大时，因无明显转折点，不能准确测定。,.,2.等摩尔连续变化法,测定方法：保持cM和cR总浓度不变；即：cM+cR=常数；连续改变cR与cM之比，配制一系列显色溶液；在max处，测。,曲线转折点所对应的cR/cM值，即为，,.,适应范围：适用于配位比低，稳定性高的配合物组成的测定。此外还可以测定络合物的不稳定常数。当络合物很稳定时，曲线的转折点明显，而络合物的稳定性稍差时，可画切线外推找出转折点。,图10-11连续变化法,.,(二)酸碱离解常数的测定,1.原理：某有机化合物的酸性官能团或碱性官能团是发色团的一部分，则该物质的吸收光谱随溶液pH值而改变，不同pH时获得不同A。,HBH+B-,.,(1)配制三种分析浓度(c=HB+B-)相等而pH不同的溶液。,2.测定方法,.,第一种溶液,pH在pKa附近，此时溶液中HB与B-共存，用1cm的吸收池在某一定的波长下，测量其吸光度：,.,第二种溶液,pH比pKa低两个