课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、了解从土壤中分离微生物的基本原理。2、了解土壤微生物测数的基本原理。3、学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。,要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：抑制大多数微生物的生长促进目的菌株的生长结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：,在此培养基中,碳源：葡萄糖氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,实验设计,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,二制备培养基,由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103107。准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管。将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,（三）样品的稀释,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点：,血球计数板的结构,它是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网，每一方格网可分为九个大方格，中央大方格就是计数室。大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。每个大方格共含有400个小方格。计数室大方格边长为1mm，底面积为1mm2，高0.1mm,所以每个计数室固定容积为0.1mm3。,计数方法,在计数时，用含16个中方格的计数板，要按对角线方位计数左上、左下、右上、右下等四个中方格（100个小方格）所含有的菌数；由此可计算得出每个小方格所含有的菌数的平均值，计数室每个小方格容积为：0.110-34001410-6(ml)计算公式：每ml菌液含菌数=NKd(N：每个小方格含菌数平均值；d：菌液稀释倍数；K=4106),2.间接计数法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,菌落计数规则：选择平均菌落数在30300间的平板1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）1）若0.5比值2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。2）若2比值或比值0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；所有菌落数均不在30300间，以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数。,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后