分子生物学第六章.ppt

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),PCR是利用热稳定DNA聚合酶在体外快速扩增(复制)某一特定DNA片段的方法。,PCR原理,1983发明PCR技术;1993获得诺贝尔化学奖,KaryB.Mullis,美国Yellowstone公园的热泉,嗜热水生细菌(Thermusaquaticus),TaqDNA聚合酶3D结构,PCR过程,1.模板变性(Denaturation)双链DNA模板在95C变性为单链DNA。2.引物退火(Annealing)引物与单链DNA互补并退火。3.延伸反应(Extention)热稳定DNA聚合酶催化子链的合成。,缓冲液(Tris-HCl,KCl)MgCl2或MgSO4DNA模板上游引物(upstreamprimer,senseprimer)下游引物(downstreamprimer,antisenseprimer)底物dNTPs热稳定DNA聚合酶,PCR反应体系,1.长度：18-24个核苷酸；2.GC：40-60；,引物设计的原则,引物长度为18-24个碱基：Tm(C)4(GC)2(AT)5ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG3GC12；AT8Tm4X122X864C,3.四种碱基随机分布；,4.引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；,5GTTGACTTGATAT3GAACTCT,5GTTGACTTGATATTCTCAAG3,引物的自身互补序列形成发夹结构,5ACCGGTAGCCACGAATTCGT3,3TGCTTAAGCACCGATGGCCA5,5ACCGGTAGCCACGAATTCGT3,两个引物分子形成二聚体,5.引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体(dimer)；,6.引物的5端可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR产物的定向克隆。,5CATATG,3,3,TTCGAA5,NdeI,HindIII,常用的热稳定DNA聚合酶,待扩增片段：1000bp引物Tm55DNA模板变性:94,5分钟;PCR循环(30次):94,30秒;50,30秒;72,1分钟;最终延伸:72,7-10分钟,PCR反应条件的设定,PCR产物的检测-琼脂糖凝胶电泳,PCR产物,PCR产物,逆转录酶以mRNA为模板合成第1条cDNA链，然后通过PCR反应扩增出许多cDNA分子拷贝。用于检测某一基因在转录水平的表达及克隆特异的cDNA,RT-PCR,一步法RT-PCRRT反应与PCR反应在同一个试管中进行。两步法RT-PCRRT反应与PCR反应在不同的试管中进行。,下游引物特异性引物Oligo(dT),-actinGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)18SrRNA,用作内参的管家基因,RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR在PCR反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号的积累实时监测PCR反应进程，对扩增的PCR产物进行定量分析的方法。具有高度敏感性：用于检测微量的DNA或RNA样品；检测每一次PCR循环中产物的积累；扩增反应结束后不需要对PCR产物进行电泳。,1.基础研究(1)基因克隆：从核酸数据库中获得特定基因的核苷酸序列，设计引物。(2)cDNA克隆：从核酸数据库中获得特定cDNA(mRNA)的核苷酸序列，设计引物。(3)基因定向突变(Site-specificmutagenesis)：引物含有突变的碱基。(4)基因表达：用RT-PCR或qRT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学(1)感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。(2)遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。(3)恶性肿瘤的诊断3.基因动、植物的检测(1)转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。(2)转基因植物的检测：玉米、大豆等。,PCR技术的应用,正常人血红蛋白亚基,镰刀型贫血病人血红蛋白亚基,镰刀型贫血病人血红蛋白亚基编码基因,正常人血红蛋白亚基编码基因,PCRDdeI酶切琼脂糖凝胶电泳,核酸分子杂交(Hybridizationofnucleicacids),核酸分子杂交两条互补的DNA单链或一条DNA单链与其互补的RNA链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交。核酸分子杂交通常是指探针与受体DNA或RNA分子的之间的杂交。探针(probe)用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸链(单链DNA或RNA分子)称为探针。探针用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。,核酸分子杂交类型及特点,转膜(印迹),琼脂糖凝胶电泳,制备受体DNA/RNA,洗膜,检测探针,制备探针,预杂交,杂交,一、探针的标记1.同位素标记的探针常用的同位素为32P、35S2.非同位素标记的探针高度灵敏感;便于检测利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明(rhodamine)等检测杂交的探针;探针稳定，并且可被反复使用多次；不会危害操作者的健康并且不污染环境；常用的非同位素标记地高辛(Digoxigenin,DIG)生物素(Biotin),3DIG标记探针的方法,二、DNA/RNA样品的制备及电泳1.DNA样品制备基因组DNA;限制性内切酶酶切基因组DNA;用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组DNA2.RNA样品制备总RNA;用变性琼脂糖凝胶电泳分离RNA,三、DNA/RNA从凝胶向膜的转移-印迹(blotting)转移方法毛细管转移(Capillarytransfer)在缓冲液中，DNA或RNA从凝胶中被动地转移到膜上。真空转移(Vacuumblotting)电转移(Electroblotting)电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。,膜支持物尼龙膜(Nylonmembrane)硝酸纤维素膜(Nitrocellulosemembrane),毛细管转移,四、将DNA/RNA固定在膜上的方法1.干烤置尼龙膜于抽真空的120C烤箱中2小时；置硝酸纤维素膜于抽真空的80C烤箱中2小时。2.UV交联作用用UV将DNA/RNA固定在尼龙膜上。,UV交联仪(UVCrosslinker),五、DIG探针与靶分子的杂交1.探针杂交前用热变性方法将双链DNA探针变性为单链DNA探针。2.杂交条件保证探针与靶分子特异杂交。,3.洗膜使探针与非特异杂交的序列分离。,探针与靶分子的杂交,六、DIG探针的检测1.在抗DIG抗体上偶联荧光素用于原位杂交2.在抗DIG抗体上偶联碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催化的底物显色反应或化学发光反应检测DIG探针信号。用于显色反应的底物NBT(氮蓝四唑盐酸盐)BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐)用于化学发光反应的底物CSPD和CDP-Star,用碱性磷酸酶检测DIG探针,显色反应的底物：NBT,BCIP化学发光反应的底物：CSPD,CDP-Star,化学发光反应,显色反应,Southern印迹,将变性的DNA分子(单链)转印到尼龙膜上,琼脂糖凝胶电泳分离酶切的DNA片段,用限制性内切酶酶切基因组DNA,预杂交：降低探针与膜结合的机会杂交：探针与靶分子杂交洗膜：洗去非特异结合探针,检测探针,DNA芯片(DNAChip)技术,DNA芯片技术是一种大规模集成的固相杂交。在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的DNA探针有序地固化于支持物表面，然后与标记的DNA或RNA样品杂交。通过检测杂交信号来分析样品的基因序列或表达信息。,Arrayer,HybridizationOven,ArrayScanner,正常细胞,mRNA,cDNA,(红色荧光染料标记的cDNA),异常细胞,mRNA,cDNA,(绿色荧光染料标记的cDNA),与芯片杂交,只在正常细胞中表达的基因,只在异常细胞中表达的基因,在正常细胞在异常细胞中等量表达的基因,在正常细胞中高表达的基因,在异常细胞中高表达的基因,在正常细胞在异常细胞中都不表达的基因,DNA序列测定(DNAsequencing),2,3-ddNTP,双脱氧链终止法(Sanger法):在DNA聚合酶的催化下，2,3-ddNTP底物通过其5-P基团掺入到延伸的DNA链中；由于缺少3-OH，后续dNTP不能与其形成磷酸二酯键，导致DNA链的合成终止。,DNA测序方法,DNA测序过程1)退火反应:使待测DNA模板热变性为单链DNA，与测序引物发生退火。2)标记反应:单链DNA模板-引物、dNTP、-35SdATP和测序酶(DNA聚合酶)。3)终止反应:将标记反应混合物分成四组，分别加入含有ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP的终止反应液。4)电泳:用变性聚丙烯酰胺凝胶分离新合成的DNA片段。5)放射自显影:根据X-光胶片上条带的位置，读出新合成DNA片段的核苷酸顺序，从而得知待测DNA链的核苷酸顺序。,3-CGTAACGTACCGATCGTCGTACTAGACA-5,3-CGTAACGTTCCGATCGTCGTACTAGACA-55-GCATTGCA3,退火反应,“A”反应DNA聚合酶dNTPddATP,“T”反应DNA聚合酶dNTPddTTP,“G”反应DNA聚合酶dNTPddGTP,“C”反应DNA聚合酶dNTPddCTP,标记反应及终止反应,测序引物结合位点,待测序DNA链,“A”反应5A35AGGCTA35AGGCTAGCA35AGGCTAGCAGCA35AGGCTAGCAGCATGA3,“G”反应5AG35AGG35AGGCTAG35AGGCTAGCAG35AGGCTAGCAGCATG35AGGCTAGCAGCATGATCTG3,“T”反应5AGGCT35AGGCTAGCAGCAT35AGGCTAGCAGCATGAT35AGGCTAGCAGCATGATCT35AGGCTAGCAGCATGATCTGT3,“C”反应5AGGC35AGGCTAGC35AGGCTAGCAGC35AGGCTAGCAGCATGATC3,测序引物,测序反应所产生的系列单链DNA片段始于测序引物结合位点并终止于ddNTP。,5AGGCTAGCAGCATGATCTGT35AGGCTAGCAGCATGATCTG35AGGCTAGCAGCATGATCT35AGGCTAGCAGCATGATC35AGGCTAGCAGCATGAT35AGGCTAGCAGCATGA35AGGCTAGCAGCATG35AGGCTAGCAGCAT35AGGCTAGCAGCA35AGGCTAGCAGC35AGGCTAGCAG35AGGCTAGCA35AGGCTAGC35AGGCTAG35AGGCTA35AGGCT35AGGC35AGG35AG35A3,GTCA,3TGTCTAGTACGACGATCGGA5,5ACAGATCATGCTGCTAGCCT3,ACTG,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放射自显影,待测链序列,电泳方向,X-光胶片,自动化DNA测序将双脱氧链终止法用于自动化DNA测序中，但用荧光染料代替同位素来标记DNA分子，荧光染料分子被激光激活后,再被光电倍增管捕获。1.末端染色测序用四种荧光染料分别标记ddNTP，测