305-牛津杯法抑菌试验

牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养，一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。2. 仪器、设备2.1 超净工作台2.2恒温培养箱：361。2.3恒温水浴锅：501。2.4高压灭菌锅。2.5平皿：直径为9 cm。2.6 移液器（20200L，1001000L，15mL）及配套无菌枪头。2.7试管：15150 mm。2.8 酒精灯。2.9试管架。 2.10涡旋混匀器。2.11摇床：361。2.12牛津杯。3. 病原菌、培养基及其他3.1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。3.2 抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。3.3 培养基：（1）大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。（2）金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。（3）沙门氏菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。（4）乳酸菌：MRS肉汤。（5）芽孢菌：营养肉汤。3.4 其它：0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37，200rpm，培养16-20h。将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0.30-0.36之间， 则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备：（1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。（2）乳酸菌扩培：无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的乳酸菌菌粉（如果是包衣产品需要在称样前无菌条件下研磨释放乳酸菌），接种于100mLMRS液体培养基中，37静置培养2448h即为扩培好的乳酸菌菌悬液。（3）芽孢菌扩培：无菌条件下称取相当于约10亿CFU量的芽孢菌菌粉，接种于100mL 营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37，200rpm，培养1418小时即为扩培好的芽孢菌菌悬液。4.3双层平皿的制备：取平皿分别倾注营养琼脂培养基15-18mL，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层，将平皿倒置平均划分区域并标记添加物。另取半固体营养琼脂培养基适量放冷至4850 ，将4.1中病原菌菌悬液原液稀释至106cfu /mL左右，每4.5mL半固体营养琼脂培养基加入0.5mL，倒入每平皿中，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。放置在水平台上冷却后，在每1平皿中以划分好的区域等距离均匀安置牛津杯4个备用。4.4 抑菌试验：取4.2步骤中准备的抑菌物质，每个双层平皿中的牛津杯中分别滴装200L，37静置培养16-20h后，测量各抑菌圈直径（或面积）以作出评价。选取典型平皿拍照片。备注：牛津杯的放置一定要平稳、到位，确保底部准确插到两层平皿之间；抑菌物质添加时确保全部加到牛津杯内部，不要洒在牛津杯外壁或外部，如果洒在外面会形成乳酸菌或芽孢菌在抑菌圈的生长；如果无法控制乳酸菌或芽孢菌在牛津杯外面的生长，可以将乳酸菌、芽孢菌菌悬液在无菌离心管中离心，取其上清加入牛津杯中做抑菌试验。4.5 抑菌性能评价抑菌性：抑菌圈10mm为无抑菌