第二章DNA复制

第二章DNA的复制,河南师范大学,问题,1、原核生物和真核生物DNA的复制会一样吗？2、DNA复制时是两条链都做模板吗？如果是的话如何解决两条链的方向问题？3、DNA链为什么不选择3-5的方向延伸呢？4、DNA复制都需要那些酶？他们是如何起作用的？5、线性DNA复制的5末端隐缩问题是如何解决的6、DNA的复制是如何保证其准确性的？意义何在？,DNA的复制,河南师范大学,本章内容,第一节DNA的半保留复制第二节复制原点、方向、和方式第三节DNA复制的酶学第四节DNA的半不连续复制第五节真核生物DNA的复制第六节DNA复制的错误校对,DNA的复制,河南师范大学,单独复制的DNA单元称为复制子（Replicon），原核细胞的复制子就是细菌染色体本身，每个真核细胞染色体都包含有大量的复制子。,河南师范大学,第一节DNA的半保留复制,DNA的半保留复制,DNA的半保留复制的证明,1958年Meselson-Stahlexperimentusing15N(theHeavyisotope)and14N(theLightisotope)togrowE.colicells证明了DNA的复制是半保留复制,DNA可能的三种复制模式,DNA的半保留复制,河南师范大学,河南师范大学,DNA的半保留复制,15N,15N,第二节复制原点、方向、和方式,复制原点：（replicationorigins）一般用o或者ori表示，是DNA的复制起始位置。结构特点：DNA呼吸作用强烈的区段，富含ATWhy复制方向：从特定位置开始的双向或者单向复制方式：复制叉式（复制）滚环式复制ReplicationforkisthepointatwhichstrandsofparentalduplexDNAareseparatedsothatreplicationcanproceed.,复制原点、方向、和方式,河南师范大学,TheelectronmicrographofthereplicationintermediateofaplasmidDNAis-shaped.,复制原点、方向、和方式,河南师范大学,ReplicatedDNAisseenasareplicationeyeflankedbynonreplicatedDNA.,复制原点、方向、和方式,河南师范大学,从两个复制原点开始的单向单链复制,从一个复制原点开始的单向双链复制,从一个复制原点开始的双向双链复制,河南师范大学,复制原点、方向、和方式,第三节DNA复制的酶学,DNA复制是核苷酸链的不断生长，那就需要将四种脱氧核苷三磷酸在酶的作用下通过磷酸二酯键连接在一起。一、脱氧核苷三磷酸的来源（生物化学）：二、酶,DNA复制的酶学,河南师范大学,DNAPolIcatalyzesthe5to3elongationofthenewstrand,河南师范大学,DNA复制的酶学,TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959,fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid,河南师范大学,一、脱氧核苷三磷酸前体的来源,废物利用：体内核酸降解或者直接来自培养基新合成：（参考生物化学）注意dTTP的合成，dUTP的渗入阻止,DNA复制的酶学,河南师范大学,二、酶（一）、DNA聚合酶,1、一个能够在模板链上合成新的DNA链的酶叫做DNA聚合酶。原核和真核生物中都包含有多种DNA聚合酶的活动。只有它们中的一部分是真正参与了复制的；有时候把这些酶叫做DNA复制酶。2、一个所有DNA聚合酶都具有的特点是：它们不能够从自由的核苷开始初始化DNA链的合成。它们需要一个引物提供一个自由的3-OH端可以加入核苷。3、原核生物的DNA聚合酶目前发现的主要有三种：分别是Pol、Pol和Pol,DNA复制的酶学,河南师范大学,OnlyoneDNApolymeraseisthereplicase.TheothersparticipateinrepairofdamagedDNA.,DNA复制的酶学,河南师范大学,DNApolymeraseI,DNApolymeraseI有四种主要的活性:1、Polymerase(DNArepairandRNAprimerreplace);2、35exonuclease(proofreading);3、53exonuclease(removingRNAprimersanddamagedDNAfragments)4、endonuclease（DNArepair）,DNA复制的酶学,河南师范大学,DNApolymerase,Pol是DNA链延长的主要的聚合酶，是一个复杂的多亚基酶，它的活性主要有：1、Polymerase(DNAreplication);2、35exonuclease(proofreading);3、53exonuclease(damagedDNAfragments),DNA复制的酶学,河南师范大学,Pol和Pol活性比较,1、Polymerase：Pol主要是DNA的修复和RNA引物的替换；Pol主要是负责链的延伸2、35exonuclease：Pol和Pol都具有该活性，主要是保证聚合作用的正确性，起校对作用，他的意义还在于它对于DNA作为遗传物质的稳定性和极高的保真度是非常重要的。,53,DNA复制的酶学,河南师范大学,3、53exonuclease:Pol和Pol都具有该活性但是区别较大：（1）Pol53外切活性只能作用于单链DNA（2）Pol的外切活性不能作用于单链DNA，只要是具有5-磷酸末端的DNAPol就可以起作用（3）Pol外切核苷酸是一个一个切去；（4）Pol不仅可以外切DNA，也可以外切RNA，在复制中就是用Pol切去RNA引物的。,DNA复制的酶学,河南师范大学,4、Pol还具有内切酶活性，它可以从5-磷酸末端切去单链的DNA,DNA复制的酶学,河南师范大学,DNApolymeraseI和nicktranslation,切刻（Nick）：双链DNA中一条上的磷酸二酯键的断裂，但是并没有缺少碱基或者核苷酸。切刻平移（Nicktranslation）：在DNApolymeraseI的聚合活性和53外切酶活性同时作用下，使双链DNA上的切刻沿着53方向有一个位置移动到另一位置，这一过程称为切刻平移。,DNA复制的酶学,河南师范大学,（二）、DNA连接酶,作用：将相邻的3-OH和5-P形成磷酸二酯键条件：必须是相邻的3-OH和5P；必须是各自的碱基处于配对状态下,53,35,Nick,53,35,Nick,A,C,DNA复制的酶学,河南师范大学,（三）、螺旋酶、旋转酶,螺旋酶（helicases）：又称解旋酶，有两种，在DNA复制中需要螺旋酶，它常常与SSB（单链DNA结合蛋白）配合，防止链间或者链内退火，需要ATP能量。DNA旋转酶（DNAgyrase）：目前只在原核生物中发现，属于拓扑异构酶，它可以引入负超螺旋同时断裂并连接双股DNA，需要ATP能量。,DNA复制的酶学,河南师范大学,Single-strandedDNAisneededforreplication,SSB：single-strandDNAbindingprotein作用：阻止已经解开的双链链间或者链内退火,DNA复制的酶学,河南师范大学,第四节DNA的半不连续复制,1、DNA的半不连续复制的发现2、引物、引发酶和引发体3、原核生物半不连续复制的过程4、几种噬菌体的复制过程,DNA的半不连续复制,河南师范大学,1、DNA的半不连续复制的发现,DNA链的生长方向是从5-3的，那么DNA的复制就可能有几种方式：,A,B,C,3535,3535,DNA的半不连续复制,河南师范大学,几个概念LaggingstrandofDNAmustgrowoverallinthe3-5directionandissynthesizeddiscontinuouslyintheformofshortfragments(5-3)thatarelaterconnectedcovalently.LeadingstrandofDNAissynthesizedcontinuouslyinthe5-3direction.Okazakifragmentsaretheshortstretchesof1000-2000basesproducedduringdiscontinuousreplication;theyarelaterjoinedintoacovalentlyintactstrand.1968年冈琦发现的因此称为OkazakifragmentsSemidiscontinuousreplicationismodeinwhichonenewstrandissynthesizedcontinuouslywhiletheotherissynthesizeddiscontinuously.,DNA的半不连续复制,河南师范大学,2、引物、引发酶和引发体PrimingisrequiredtostartDNAsynthesis,DNA聚合酶不能初始一个脱氧核糖核酸链，必须要由一个引导行为提供一个自由的3-OH端开始前导链和后随链的合成。前导链只需要一次这样的初始事件，是在复制起点开始的。但是后随链必须要有一系列的初始事件。因为每一个冈崎片段都需要自己重新开始。每一个冈崎片段都是由一个引物开始的。这个引物可以具有多种形式：,DNA的半不连续复制,河南师范大学,1、一个RNA序列（约10bp），RNA链的3-OH自由端会被DNA聚合酶延伸。细菌DNA和一些病毒复制时使用。2、一个事先形成的RNA和模版配对，允许它的3-OH端被用来引导DNA的合成。这种机制在反转录病毒中被用来引导RNA的反转录。3、一个引导点在双链DNA中产生。最常见的机制是通过引入一个切刻。在这种情况下，事先形成的链由新生成的链替代。（注意这和切刻平移的不同，切刻平移中，DNA聚合酶I在切刻同时生成并且降解DNA。）少数病毒使用4、一个蛋白质可以直接引导反应，它可以直接向DNA聚合酶提供一个核苷。这种方式有一些病毒采用。,河南师范大学,DNA的半不连续复制,PrimingisrequiredtostartDNAsynthesis,ADNApolymeraserequiresa3-OHendtoinitiatereplication.,DNA的半不连续复制,河南师范大学,3、原核生物半不连续复制的过程,起始延伸终止,DNA的半不连续复制,河南师范大学,起始,Initiationrequiresseveralenzymaticactivities,includinghelicases,single-strandbindingproteins,andsynthesisoftheprimer.,DNA的半不连续复制,河南师范大学,DNA的半不连续复制,河南师范大学,(DNAgyrase),DNA的半不连续复制,河南师范大学,4、几种典型的复制方式,单链环形DNA噬菌体：M13、G4、174双链线性DNA噬菌体：T7双链环状DNA噬菌体：噬菌体哺乳动物线粒体DNA的复制：D噜噗滚环复制D噜噗（D-loop）：DNA在复制起点开始复制时，总是先出现一个复制泡，其中先导链已经引发并开始合成，与其摸板形成双链结构，而另一条亲本链则被先导链置换出来。这样的由一条单链和一条双链组成的三元泡状结构称为D噜噗,DNA的半不连续复制,河南师范大学,TheDloopmaintainsanopeninginmammalianmitochondrialDNA,whichhasseparateoriginsforthereplicationofeachstrand.,DNA的半不连续复制,河南师范大学,第五节真核生物的DNA复制,1、真核生物的DNA聚合酶2、真核生物DNA复制过程3、线性DNA复制结束后的5末端隐缩问题,真核生物的DNA复制,河南师范大学,1、真核生物的DNA聚合酶,聚合酶主要有四种：、。目前发现除聚合酶外其它三种聚合酶只有聚合作用，聚合酶除了聚合作用外还有35外切活性。它们的主要生物学作用是：聚合酶、协同作用主要是负责DNA复制的聚合酶作用不明可能是DNA修复有关聚合酶主要是负责线粒体DNA复制的，因为它是目前发现的唯一存在于线粒体中的DNA聚合酶真核生物细胞中DNA聚合酶分子数目要比原核的多,真核生物的DNA复制,河南师范大学,2、真核生物DNA复制过程,DNAreplicationineukaryoticcellsuseessentiallythesameprinciplesbutmorecomplexinthedetails.真核生物DNA复制过程是一个更为复杂的过程，仍有许多的未解之谜，比如复制的引发复合体，5末端隐缩问题等,真核生物的DNA复制,3、DNA复制结束时的5末端隐缩问题,河南师范大学,真核生物的DNA复制,5末端隐缩问题的解决机制,环状DNA：不存在此问题线状DNA：噬菌体：末端冗余，形成连环分子腺病毒：在其末端存在一个末端蛋白，它的丝氨酸有一个活性-OH，可以和5-P形成磷酸二酯键，补平因末端RNA引物去除留下的空白真核生物：端粒,河南师范大学,真核生物的DNA复制,第六节DNA复制中错误的校对,复制的精度依赖于碱基配对的准确性。然而，当我们考虑到碱基配对所涉及到的一些反应的时候，实际上细菌中的错误率看起来大约为10-8-10-10。这相当于每一个基因组的每1000次复制才只有大约一次错误，或者是每一个基