病毒性肝炎：HBV和HCV(2012).ppt

病毒性肝炎：HBV和HCV实验诊断新进展,吴尚为博士广州金域医学检验中心感染性疾病医学总监、微生物室主任天津医科大学检验学院教授、博士生导师2013,主要内容,乙型病毒性肝炎的实验诊断对慢性乙型肝炎的新认识对HBV感染实验诊断的新认识广东HBV感染概况HCV实验诊断新进展,1,定义：HBV感染人体后，可从血中测得抗原和抗体类物质，称为血清标志物（SerologicalMarker，SM）；同时，也可测出病毒的基因组核酸或其它相关核酸，如HBV-DNA和HBV-DNAp，称为分子标志物（MolecularMarker，MM)；这些标志物的存在和变化，反映病毒在宿主中的状态和病情的发展情况，是病毒性肝炎的重要实验室诊断依据。,HBV实验诊断：血清标志物,2,HBV实验诊断：SM结果经典判读,3,HBV实验诊断：分子标志物,目的：通过检测HBV核酸（DNA）在血中的浓度（载量），证实HBV及其复制的存在HBV血清浓度或载量参考值-103cp/mL，提示有病毒复制-WHO提议统一使用国际单位IU/mL，1IU=5cp临床意义-诊断HBV病毒血症-提示传染性-监测HBV-DNA的血清浓度-评估肝脏病变的活动性-预测肝癌发生的可能性及相关病死率-鉴别非活动性HBV携带者和HBeAg(-)CHB-决定是否执行抗病毒治疗-判断疗效和提示耐药株的出现,4,指导抗病毒治疗-需要抗病毒治疗：104cp/mL+ALT升高或肝脏进行性损坏（肝穿）-治疗有效：用药3-6个月后，HBVDNA转阴或下降超过102cp/mL预后评估：“HBV载量是乙肝预后的唯一决定因素”,5,HBV实验诊断：HBV-DNA定量检测,HBV实验诊断：标志物临床意义评述,HBVsm的提示作用和局限性-判断是否有或曾经有HBV感染-结果与宿主的免疫应答关系密切，侧重于反映病情-众多超出经典解释范畴的非典型结果产生：原因是宿主固有的个体差异、免疫应答的不同、抗病毒治疗选择出变异株（例如，25组结果对应40余项临床意义）HBVmm的提示作用和局限性-根据HBV野型株复制的程度进行“现症”诊断-对宿主的感染状态和肝组织病变无直接提示作用-通过检测载量的变化间接进行诊断和预后评估,6,HBV实验诊断：SM的“非典”结果（1）,HBVsm解读困难：一组结果对应多项临床意义,取自：达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒检测新技术第19页,7,HBV实验诊断：SM的“非典”结果（2）,8,HBVsm解读困难：一种临床情况对应多组结果,取自：达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒检测新技术第19页,HBV实验诊断：SM和MM相关性（1）,9,*“两对半”全阴性；#仅检测HBsAg,HBV实验诊断：SM和MM相关性（2）,10,“大三阳”组的高HBV-DNA检出率和载量与HBVsm的临床意义具有高度一致性“小三阳”组HBV-DNA检出率及载量，“颠覆”了对“小三阳”的传统认识-真正“好转或恢复”的比例有多高？-还能以HBeAg作为传染性的指标吗？在各种HBVsm表型中，均可检出HBV-DNA-HBsAg阳性者中的“低”HBV-DNA检出率-HBsAg阴性者中的“高”HBV-DNA检出率单独检测SM或MM都不能作出全面、肯定的诊断，联合检测能可以优势互补，但仍不能解释全部疑问,对CHB新认识：基因变异与临床,11,HBV核酸序列变异：A-H8个基因型；基因分型前C基因区变异：HBeAg(-)CHB；HBV仍在复制，但HBeAg(-)，造成病情好转、传染性下降等的误判P基因区变异：核苷类耐药性；疗效下降甚至失败S-C-X区多点变异：“HBsAg假阴性”；产生HBV2S基因区变异：“HBsAg假阴性”；HBsAg血清型改变，检测试剂无法识别HBV-DNA逆向整合：“HBsAg假阳性”；无HBV复制，仍产生HBsAg,HBV基因变异的临床后果,对CHB新认识：自然病史和临床分型（1）,12,HBV-DNA定量的重要作用-“公认”的HBV感染现症诊断依据-为临床分期或分型的主要参考-是确定治疗必要性和观测疗效的主要指标HBV感染根据宿主免疫状态和病毒复制率分为四期-免疫耐受期（Immunetolerance）-HBeAg(+)CHB-HBeAg(-)CHB-非活动性携带（Inactivecarrier）ALT的改变仍是反映病情变化的重要参考,对CHB新认识：自然病史和临床分型（2）,13,肝硬化和/或肝癌,前C区突变病毒复制反弹,HBeAg转换,HBeAg逆转换病毒复制反弹,HBV清除,对CHB新认识：HBV基因分型（1）,14,HBV优势基因型全球地理分布,对CHB新认识：HBV基因分型（2）,15,HBV优势基因型在国内的地理分布国内可见四个基因型，各型所占比例如下：A,1%；B,41%；C,53%；D,4%北方主要流行C型南方主要流行B型广深地区B、C型流行情况相当少数民族地区主要为A和D型，如西藏地区流行D型为主,对CHB新认识：HBV基因分型（3）,16,HBV基因型和表型的关系,对CHB新认识：HBV基因分型（4）,17,基因分型的意义-获得HBV的流行病学信息-根据基因型对病情进行初步评估-作为治疗方案制定和药物选择的参考基因分型的方法-实时PCR法检测B型和C型-S基因区测序检测A型和D型基因分型的适应症-所有血清HBV-DNA阳性的HBV感染者-特别是需进行抗病毒治疗者,对CHB新认识：前区基因突变（1）,18,变异的分子基础-前C区：形成终止密码子，使HBeAg不能表达-BCP区：抑制前CmRNA转录，降低HBeAg的合成临床后果-产生HBeAg“假阴性”变异株；HBV仍在复制，HBeAg表现为阴性，即“HBeAg(-)CHB”-BCP区变异是肝癌发生的独立危险因素之一-双变异可提高病毒复制率，并与炎症活动性和肝功能损害程度有关,对CHB新认识：前区基因突变（2）,19,HBeAg(-)CHB的诊断标准-HBsAg(+),HBeAg(-),HBeAb(+/-)-血清HBV-DNA104cp/mL-ALT持续或反复升高-肝活检不同程度炎症变HBeAg(-)CHB的特点和重要性-因HBeAg的“假阴性”造成误判，将活动病情误认为好转或恢复；将有传染性误认为传染性下降或无传染性-在慢性乙肝患者中，已达极高比例-病情重、预后差-抗病毒治疗效果不好,对CHB新认识：前区基因突变（3）,20,HBeAg(-)CHB在CHB中所占的比例-意大利、西班牙、希腊：近90%-中国：37-70%HBeAg(-)CHB与肝癌发生-HBeAg(+)CHB：5-19%-HBeAg(-)CHB：15-31%HBeAg(-)CHB与肝硬化发生率-HBeAg(+)CHB：20-26%-HBeAg(-)CHB：40-74%急性肝衰抗病毒治疗：因替卡韦治疗存活率-HBeAg(+)CHB：80%-HBeAg(-)CHB：54%,对CHB新认识：前区基因突变（4）,21,前C区变异检测方法-HBV前C区变异基因芯片检测法-PCR扩增+杂交法检测前C区变异检测的临床意义-非自然转换HBeAg(-)HBV株的发现-评估耐药株出现的风险-病程监测和预后评估前C区变异检测的适应症-诊断性检测：HBeAg(-)的HBV感染者-监测性检测：治疗中的HBeAg(+)感染者,对CHB新认识：耐药性基因突变（1）,22,抗病毒药物治疗-是治疗HBV感染的核心手段-核苷类似物为最常用的抗病毒药物，包括：拉米夫定（LAM）、阿德福韦（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替诺福韦（TNV）和替比夫定（LdT）-该类药物通过抑制HBV逆转录酶而抑制病毒的复制耐药性产生-病毒聚合酶基因发生变异，超过90%的耐药性相关变异发生在YMDD区-长期用药选择出随机变异的HBV病毒株，导致病毒复制反弹,对CHB新认识：耐药性基因突变（2）,23,HBV产生耐药性的过程和基本概念,对CHB新认识：耐药性基因突变（3）,24,耐药性突变位点在HBV基因组中的分布,对CHB新认识：耐药性基因突变（4）,25,HBV产生耐药性的时间因素,对CHB新认识：耐药性基因突变（5）,26,HBV耐药性进化旁路和交叉耐药表型,A,M204V/II169TV173LM250V;B,M204V/IT184GS202I/G,对CHB新认识：耐药性基因突变（6）,27,耐药性突变的检测方法-实时PCR法检测YMDD位点：拉米夫定-线性探针反向杂交法：阿德福韦酯-PCR产物测序法：全部和新出现突变点检测耐药变异检测的临床意义-抗病毒治疗方案的确定、调整和疗效预估-抗病毒疗效的监测适应症-治疗前排除耐药突变株引起的感染（有争议）-用药过程中的监测，每3-6个月检测一次,实验诊断新认识：有价值的HBV标志物,第一代HBV实验室检测项目-HBsAg：筛查和诊断-HBeAg：诊断、传染性判断、病情和疗效评估-HBcAb：免疫力获得和急慢性判断-HBV-DNA定量：现症诊断、疗效判断和监测及预后评估第二代HBV实验室检测项目-基因分型：治疗方案选定、疗效和转归预估-前C/BCP突变：确定HBeAg(-)CHB、治疗方案选定、疗效和转归预估-耐药性突变：鉴定耐药株、治疗方案选定和调整,28,实验诊断新认识：感染的明确诊断,不同HBV感染状态的重要实验室检测指标变化,要点补充1.HBV-DNA定量已成为诊断和临床分型的核心指标2.HBV-DNA定量阳性者，被强烈推荐进行基因分型3.对HBeAg(-)者，应检测前C/BCP基因突变,29,时间间隔和基本项目-时间：每3-6个月，任何治疗方案和HBe血清状态-基本项目：HBV-DNA定量和ALTHBeAg转换-对HBeAg(+)CHB治疗，仍可作为监测指标-HBeAg(-)CHB的出现：HBeAg阴转，不伴HBV-DNA水平下降（阴性或10MU/mL，机体有免疫力-免疫注射后数年，10MU/mL，需补种疫苗-qHBsAb可检测疫苗接种效果-qHBsAb可预测免疫持续时间qHBeAb与乙肝免疫球蛋白（HBIG）-在肝移植时，HBIG用于保护供体肝脏-根据qHBsAg和/或qHBsAb检测结果，可以决定HBIG使用剂量和周期,乙肝五项定量：金域现状,37,项目已开展-五项每月各2000余份金域使用的技术平台：均为化学发光法,广东HBV感染：HBV-DNA检出,38,资料来源和分析方法-广州金域基因室HBsAg携带者HBV-DNA定量检测结果-时间和数量：2007年全年，15664份；2010上半年，30747份-分析方法：回顾性资料分析-分析内容：HBV-DNA检出率和载量中值；感染状态分析；HBeAg(-)CHB和HBeAg(+)CHB；HBV感染的年龄、性别和地区特征等,结果解读：2010与2007相比，HBV-DNA阳性率略升高，载量略下降；HBV现症感染男性高于女性；Chi-Squaretest,p0.05,39,*IAC,非活动性携带（InactiveCarrier）；潜在，感染状态分组无ALT、肝组织活检等资料支持,广东HBV感染：感染状态,广东HBV感染：HBeAg(-)CHB,40,41,结果解读在育龄女性HBsAg(+)者中，HBV-DNA检出率和载量随年龄增长而降低；2010较2007，26-30和31-35组，阳性率有上升趋势；Chi-Squaretest，p0.05；HBV-DNA检出率和病毒载量处在不容忽视水平，特别是低年龄组,广东HBV感染：育龄女性,HBV是乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要致病因素虽经努力，我国仍为HBV感染高流行区，广东地区尤甚宿主免疫因素和病毒的高变异特征，已使传统的乙肝血清学检查难以提供明确可靠的实验室诊断分子技术引发对HBV感染的重新认识并提高了诊断水平HBV-DNA定量已成为诊断、疗效监测及预后评估的核心HBV基因分型有助于治疗方案的优化及对病情转归的判断前C/BCP区突变检测确定HBeAg(-)CHB，对治疗和预后提供参考耐药性突变检测提高治疗针对性，使“个性化”治疗成为可能对HBV-DNA检测结果回顾性分析获得HBV感染的重要宏观信息,HBV要点回顾,42,43,HCV新进展：筛查（1）,筛查的意义-HCV感染率：世界，2%；中国，3%-血制品筛查：US急性HC，2.5/10万（1992）至0.3/10万（2006）筛查原则：针对目标人群-高危：静脉瘾君子、血友病接受浓缩凝血因子者、HIV感染者-中危：筛查实施前受血者和器官移植受体、原因不明ALT升高者、HCV阳性母亲的婴儿-低危：多性伴或性伴侣HCV阳性、HCV密切接触医务工作者标准方法：Anti-HCV，EIA和ELISA,44,HCV新进展：筛查（2）,美国克利夫兰医学中心HCV筛查路径,45,HCV新进展：感染证实,HCV-RNA检测是证实HCV感染的基本方法,HCV-RNA检测：PCR定性和定量HCV-RNA检测的适用对象-Anti-HCV阳性者-需进行抗-HCV治疗的HCV感染者-Anti-HCV阴性，原因不详肝病、免疫抑制或疑为急性HCV感染者HCV载量检测的意义-HCV载量与症状、肝组织损伤程度、病程或转归无相关性-是观察对治疗应答情况的核心指标-在开始治疗前应检测HCV载量以确定基线,46,HCV新进展：基因分型（1）,HCV基因型：根据基因组序列不同分为6个基因型及若干亚型基因型分布有明显的地域性差异-美国：1型为优势，占70%-75%；2和3型，25%-30%-中国：1和2型为优势，各占50%和20%-埃及和阿拉伯半岛：4型为优势HCV基因分型的临床意义-流行病学：传染源和传播途径的追寻-转归：1b型慢转率（90%）明显高于其它型（35%-50%）-干扰素治疗：1b、高载量治疗无应答的确定指征-干扰素和利巴韦林联合治疗：持续病毒学应答（Sustainedvirologicalresponse，SVR）1型，54%-65%；2和3型，80%-95%；4和6型，介于之间,47,HCV新进展：基因分型（2）,PegIFN-2a与利巴韦林联合治疗剂量和疗程推荐荷兰慢性HCV感染治疗指南（2008）,aRVR=快速病毒应答（RapidViralResponse）,4周治疗后HCV-RNA50IUmLb回顾性研究表明，PegIFN-2b在2或3型HCV感染者表现出较高的长久病毒应答（SVR），与利巴韦林剂量相关。,48,HCV感染宿主基因多态性与“个性化治疗”的实现,问题提出-干扰素和利巴韦林治疗HCV仅50%有效-感染率、疗效和预后存在人种和个体差异