]酵母双杂交PPT课件

-,1,1,酵母双杂交系统YeastTwo-hybridSystem,酵母双杂交系统是研究蛋白质间相互作用的一种分子生物学方法。该方法在研究蛋白质组学领域有重要地位和作用。,-,2,传统的检测蛋白质相互作用的方法,蛋白质亲和层析（proteinaffinitychromatography）2.亲和印迹（affinityblotting）3.免疫沉淀（immunoprecipitation）反映的只是蛋白的体外相互作用,2,-,3,蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。近年，随着分子生物学技术的发展，人们对基因的结构和功能的认识不断加深，尤其是基因组研究的飞速进展，为揭示生命的奥秘提供了条件。然而，只凭借基因序列很难认识蛋白质的功能及在整个细胞中所处的位置和作用。由于蛋白质相互作用的复杂性，使得这方面的研究工作进展缓慢。最近兴起的双杂交系统为研究蛋白质的相互作用提供了一套崭新的方法。,-,4,酵母双杂交系统的基本原理,-,5,A,TheDNA-BD/proteinX(bait)hybridbindstotheGAL1UASbutcannotactivatetranscriptionwithouttheactivationdomain(AD).,-,6,Intheabsenceofbaitprotein,theAD/libraryfusionproteincannotbindtotheGAL4UASandthusdoesnotactivatetranscription.,B,-,7,InteractionbetweenthebaitandlibraryproteinsinvivoaactivatestranscriptionofThereportergene.,C,-,8,构建诱饵蛋白质粒(BD质粒)检查BD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)文库质粒(AD质粒)转化带有BD质粒的酵母菌，铺SD/四缺平板挑his+、ade+双阳性克隆作-galactosidase分析，消除假阳性-gal分析阳性质粒在SD/四缺平板与摇管中传代，去除无效AD质粒传代阳性酵母质粒分离，转化大肠杆菌，获得大量阳性AD质粒检查AD质粒单独是否能激活报告基因转录(如果不能，继续)AD质粒转化带有BD质粒的酵母菌，再次验证其相互作用阳性AD质粒测序，按在酵母中读框方式进行蛋白同源性查询如果找到候选蛋白，克隆其如果找不到候选蛋白，有可能全基因，采用GST融合表达是新基因，可进一步分析，设技术和体外翻译技术在蛋白计引物，克隆全基因并进一步验证基因在真核细胞中的表达及定位分析图三双杂交系统文库筛选过程流程图,-,9,图1双杂交系统工作原理示意图Fig.1ModeloftranscriptionalactivationbyreconstitutionofGal4activity,a.天然Gal4蛋白具有DNA结合域和转录激活域，诱导Gal1-LacZ转录；b.只有DNA结合域（上）或转录激活域（下）的杂合蛋白不能激活报告基因的转录；c.蛋白X和Y之间的相互作用使Gal4的两个结构域接近导致报告基因的转录a.thenativeGal4proteincontainsbothDNA-bindingandactivatingregionsandinducesGal1-LacZtranscription;b.hybridscontainingeitherDB(upper)orAD(lower)areincapableofinducingtranscription;c.aprotein-proteininteractionbetweenproteinsXandYbringstheGal4domainsintoclosesproximityandresultsintranscriptionalactivity,-,10,双杂交系统是由Fields和Song于1989年提出的1。它的建立是基于对真核生物掉空转录起始过程的认识，细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子，例如酵母转录因子Gal4，在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开、功能上相互独立的结构域（domain）构成。其中有DNA结合结构域（DNAbondingdomain,DNA-BD）和转录激活结构域（activationdomain,DNA-AD。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但是不能激活转录，只有当两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（uostreamactivatingsequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。,-,11,天然Gal4分子由一条多肽链组成，含881个氨基酸。它有两个结构域：DNA结合域（DNA-bindingdomain,DB），由位于N-末端的1147个氨基酸构成，能够识别位于Gal1基因的上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS），此外，在其N-端还具有一段核定位序列；转录激活域（DNA-activating,AD），由位于C-末端的768881位氨基酸构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。,-,12,Fields等以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型设计了一个新的检测蛋白-蛋白相互作用的系统。将Snf1与DB融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其中，Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一个结合蛋白。研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY：171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。,-,13,图2普通双杂交系统的组成示意图,一般地，将DB-X的融合蛋白称作诱饵（bait），X往往是已知蛋白；AD-Y称作猎物（prey），Y称作猎物；整个实验过程称作“狩猎”（hunt或fish）,-,14,双杂交系统的发展,1.报告基因的多样化2.诱饵表达载体3.猎物表达载体,-,15,除了LacZ外，还利用了酵母的营养缺陷型，如Leu2和His3。此外，还发展了双报告基因系统。即未知蛋白Y与两个不同的AD融合，分别引起两个报告基因的转录。这样，实验结果的可靠性增大，敏感性增强。报告基因以多拷贝质粒的形式存在，或整合入酵母基因组中。,报告基因的多样化,-,16,在MATCHMAKERTwo-HybridSysterm3中首次采用his3、ade2和lacZ三个报告基因，并采用三个不同的启动子，大大降低了假阳性的出现率,-,17,图3双报告基因系统,-,18,常用的有两种：Gal4和来自E.coli的LexA，它结合于LexA操纵子上。二者的差别在于LexA不具有核定位序列。,诱饵表达载体,-,19,猎物表达载体,a.VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于其他两个；酵母Gal4的转录激活域；c.B42来自E.coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达对细胞的影响，并且在B42后有流感病毒HA抗原，易于将蛋白分离纯化,-,20,-,21,针对非核内蛋白质,在酵母双杂交系统中，BD-X和AD-Y在酵母细胞核内发生相互作用，表达的融合蛋白需要定向到核内来激活报告基因的转录，这就可能限制了大量非核内蛋白质，如膜蛋白，分泌蛋白，膜受体及胞质蛋白等在此系统中的应用。针对这个问题，发展了其它方法。SOS恢复系统（sosrecruitmentsystem,SRS）是针对于膜受体，细胞外分泌蛋白的一种方法。酵母的温度敏感株，ras途径突变体，由于缺乏鸟苷酸交换因子（guanylnucleotideexchangefactor,GEF）cdc25-2，所以不能将外来信号传递给膜上的RAS蛋白，致使酵母突变体在36不能存活。如果引入正常SOS蛋白，使SOS蛋白与RAS接近则可以使细胞存活。Arpnheim等将GEF蛋白（SOS蛋白）与X融合，蛋白Y与豆蔻酰化信号融合，使Y定位于膜上。这样，若X与Y结合，则X连同的SOS蛋白就会定位于膜上而靠近膜上的RAS蛋白，激活ras途径，完成SOS过程，能在36下生长（图10）。这一系统的建立冲破了许多的局限。,-,22,图10SOS恢复系统Fig.10SOSrecruitmentsystem,-,23,三杂交系统两个蛋白之间通过第三者发生相互作用。第三物可以是蛋白质、小分子或RNA。,三杂交系统,-,24,依赖于蛋白质的三杂交系统,-,25,图5蛋白质三杂交系统Fig.5protein-dependentthree-hybridsystem.,a.蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用；b.蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用；c.蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用teinZstabilizestheinteractionofAandB;b.ZcontactsAandBwithdifferentsurfaces;c.ZmodifiesAanddissociates.ModifiedAthencontactsB,-,26,通过小分子（配体）相互作用的三杂交系统（图6），小分子与其受体的相互作用不仅是许多生物学过程的基础，而且在医学领域有重要的价值。,通过小分子（配体）相互作用的三杂交系统,-,27,图6通过小分子的三杂交系统Fig.6smallligands-dependentthree-hybridsystemGlucoroticoid地塞米松;Glucoroticoidreceptor糖皮质激素受体,Licitra等利用FK506与地塞米松杂合分子，将与LexA-BD融合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵，用于筛选与AD融合的JurkatcDNA文库，分离了与FK506结合的蛋白FKBP1211。,-,28,通过RNA的三杂交系统（图7），RNA与蛋白质的相互作用是某些生命活动的基础，如转录、mRNA的剪切及RNA病毒与宿主之间的作用等。Wichens等提出了分析RNA与蛋白相互作用的方法,通过RNA的三杂交系统,-,29,图7RNA介导的三杂交系统Fig.7RNA-dependentthree-hybridsystemRNAbindingdomain1：RNA结合域1;RNAbindingdomain2：RNA结合域2;HybridRNA：RNA杂合分子,在这个系统中，与AD融合的蛋白是一个具有RNA结合域的蛋白（如细菌MS2），能够与RNA分子的臂-环结构结合；RNA除具有臂-环结构外，还有诱饵序列（test）。这样RNA分子与DB-蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报告基因的上游；第3个分子是AD-蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列test并结合，则报告基因转录。该系统用于确定识别目的RNA的蛋白质的RNA结合域，也可以研究被已知蛋白质识别的RNA序列。利用这个系统成功地发现了许多RNA与蛋白质之间的相互作用。包括铁离子调节蛋白与铁反应元件的结合12；HIV翻译激活因子Tat与Tar反应元件RNA序列的结合等,-,30,Vidal等提出的负选择系统用于研究相互作用的蛋白间的结构特征，筛选蛋白突变体，也可用于确定能够打破特异的蛋白相互作用的试剂。其原理在于BD-X/AD-Y激活的报告基因转录在特定的条件下是有毒性的，而相互作用的解除提供了可选择性。表达URA3基因的酵母在缺乏5-氟乳清酸的培养基上能够正常生长。在含5-氟乳清酸的培养基上培养时，由于该酶的作用，将5-氟乳清酸转变成毒性复合物，使细胞停止生长或死亡。,负选择系统,-,31,图8负选择系统Fig.8counterselectablereportersa报告基因不转录，细胞生长；b报告基因转录，细胞不生长或死亡（URA3在含5-氟乳清酸培养基上）a.reportergenedoesnttranscript;b.reportergenetranscript,andcellnogrowthordeath,-,32,双诱饵系统,-,33,图9双诱饵系统Fig.9Atwo-baitsystem,-,34,大规模进行双杂交筛选的方法,大规模进行双杂交筛选的方法，建立在酵母本身特性的基础上。酵母有不同的接合型，可以以单倍体和二倍体形式存在。当单倍体细胞并排排列时，能接合形成二倍体。这样，就为两个质粒进入同一细胞核提供了简单的途径。也就是说，当两个带有不同融合蛋白质粒的单倍体接合后，可以在二倍体中检测报告基因的转录情况。这种方法用于大量文库的筛选工作，可以大大增加所检测的蛋白的数量,-,35,图11大规模双杂交筛选的方法Fig.11interactionmatingmethods,矩阵