糖尿病基因治疗的现状及展望.doc

糖尿病基因治疗的现状及展望彭博 综述（哈尔滨医科大学）摘要 糖尿病是伴有不同程度胰岛素缺乏或胰岛功能障碍的一类代谢性疾病。由于当今治疗1型糖尿病的方法在预防长期并发症方面收效甚微，研究者试图找出一种有效的疗法来再生胰岛细胞，分化多能干细胞，和/或重新编码自体非体细胞如肝细胞成为胰岛素分泌细胞达到重建葡萄糖稳态的目的。本篇文章将从糖尿病基因治疗的策略、关键基因以及基因治疗的载体这三个方面来进行论述。关键词 糖尿病；基因治疗；胰岛素分泌细胞 ；胰腺转录因子The current status and prospect of gene therapy for diabetes mellitusPeng Bo（Harbin Medical University） Abstract Diabetes is a metabolic disease associated with varying degrees of insulin deficiency or islet dysfunction. Because current methods for treating type 1 diabetes (T1D) are ineffective in proventing long-term complications, researchers have sought to indentify alternative therapies that regenerate pancreatic beta cells, differentiate pluripotent/progrnitor stem cells, and/or reprogram autologous non-pancreatic somatic cells, such as liver cells, into insulin-producing cells (IPCs) for restoring glucose homeostasis. In this paper, we will elaborate on the key genes, vectors and strategies of gene therapy in the treatment of diabetes mellitus.Key words diabetes, gene therapy, insulin-producing cells (IPCs), pancreatic transcription factors (PTFs).1、糖尿病概况及治疗现状2013年全世界范围内糖尿病患者已经达到了3.82亿人，统计数据显示，预计2040年将达到5.93亿人。在过去的几十年里，我们对于糖尿病病理生理学的认知取得了明显进展。糖尿病主要包括1型糖尿病和2型糖尿病，1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM），由于胰岛素的绝对缺乏产生的一种青少年型糖尿病。目前认为免疫功能紊乱是T1DM的主要发病机制，T1DM具有较强的遗传易感性，这类患者与环境诱发因素接触后便可触发T细胞功能改变，产生大量的白介素2，干扰素等因子引起胰岛的炎症反应，导致胰岛细胞损坏和功能障碍1。2型主要发生于成人期，通常与不良生活习惯导致的肥胖相关，外周组织（肌肉，肝脏等）对胰岛素敏感性下降，早期表现为高胰岛素血症和胰岛素抵抗，持续发生的高血糖损伤细胞，使得细胞胰岛素分泌水平降低而发病。糖尿病人中晚期通常可发展为严重的并发症。并发症分为急性和慢性两种，其中急性并发症以酮症酸中毒为主，慢性并发症从根本上影响身体各器官系统的功能，其中包括肾衰竭，心血管疾病，神经系统功能障碍，失明以及导致截肢的四肢坏死和坏疽。二十世纪20年代胰岛素的发现彻底变革了糖尿病的治疗手段，极大地减少了急性并发症酮症酸中毒的发生。然而，慢性并发症取代急性并发症成为糖尿病致残率和死亡率高居不下的主要原因。目前人们已达成共识，精准地控制血糖水平在糖尿病的治疗中至关重要，这可预防或大大推迟慢性并发症的发病，降低糖尿病的致残率和致死率。药物和胰岛素治疗过程中诱发的低血糖症是达到完美控制血糖的一个限制因素2,3。虽然如此，胰岛素增敏剂，胰岛素分泌增强剂和新型胰岛素的应用已经降低了医源性低血糖症的发生率，如今对血糖的控制比过去好得多。虽然目前在糖尿病治疗方面已经取得了重大的进展，但对于大多数糖尿病人来说仍然无法完美地控制血糖。胰岛素替代疗法是目前临床治疗糖尿病的主要手段，但是外源性胰岛素不可能产生精确模仿胰岛素自然动力学的胰岛素曲线。胰岛移植是糖尿病治疗较为理想的方案，胰岛移植成功的大多数糖尿病患者可以摆脱胰岛素注射治疗，但是离恢复正常的胰岛素葡萄糖动力学的目标还有较大的差距4，胰岛移植也受到捐赠者适用性的限制，因为每一次成功的移植需要来自两个甚至更多的捐赠者的胰岛5,6。此外，进行胰岛移植的患者必须接受长期甚至终身的免疫抑制疗法。基于这些现状，研究者试图找出一种高效的疗法来再生胰岛细胞，分化多能干细胞，和/或重新编码自体非体细胞如肝细胞成为胰岛素分泌细胞达到重建葡萄糖稳态的目的。2.糖尿病基因治疗的策略糖尿病体内基因治疗主要有三个策略，第一类为编码的蛋白质能够促进葡萄糖利用或抑制肝葡萄糖合成的基因的转移；第二类为葡萄糖反应性胰岛素基因的转移；第三类为促进肝中细胞新生或诱导胰岛素分泌细胞的基因治疗。2.1用于降低血糖的非胰岛素基因的转移两种非胰岛素转基因应用于降低血糖，这两类基因主要通过抑制肝中葡萄糖生成和增加外周组织葡萄糖的利用发挥作用。在第一类基因的研究中，葡糖激酶（Gck）的基因转移主要在在啮齿动物的不同种群中实施7。葡糖激酶之前被分类为一种能降低肝中葡萄糖生成的转基因11，然而在他们的研究中，肝葡萄糖生成并未被直接测定，Gck主要的下游效应很可能是增加葡萄糖的利用。在STZ诱导的糖尿病小鼠的骨骼肌中Gck的过度表达可明显刺激葡萄糖利用，并防止高血糖症的发生。另一种下调肝中葡萄糖生成的方法是通过糖原靶向蛋白质的过度表达将葡萄糖转化为糖原12,13。这种蛋白是蛋白磷酸酶1的糖原靶向亚基家族的成员，可以调节糖原的新陈代谢。在小鼠中腺病毒介导的糖原靶向蛋白质的转化可以显著地刺激肝中糖原合成并降低血糖水平。2.2葡萄糖反应性胰岛素基因的转移这一策略是通过胰岛素基因变异型向肝细胞中的传递实现的。这种被修饰的胰岛素基因的变异型要么使胰岛素原更容易加工为成熟胰岛素或消除加工的必要，要么促进对血糖浓度变化敏感的基因的表达14。胰岛素基因治疗最具挑战性的部分在于给予表达的胰岛素转基因以葡萄糖反应性。正常细胞是非常巧妙的：它们通过几乎瞬时爆发式产生胰岛素来对葡萄糖浓度的变化产生反应。不同研究者使用不同的葡萄糖反应性启动子，如L-丙酮酸激酶基因的元件，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因的启动子，葡萄糖-6-磷酸酶基因以及其他基因，这些启动子通过血糖水平的变化使处于转录水平的胰岛素转基因在1-2小时内得到调节，使处于蛋白质分泌水平的胰岛素转基因通过血糖水平的变化在3-4小时内得到调节。当血糖正常或处于低水平时，这些启动子的关闭需要很长时间。由于分泌反应的延迟效应，通过转录调节的胰岛素转基因对血糖的控制通常是不稳定的，低血糖症是一个主要的并发症。2.3促进肝中细胞新生或诱导胰岛素分泌细胞的基因治疗2.3.1 肝细胞作为靶细胞的生物学基础 据报道，多种细胞和组织如胚胎干细胞，肝脏，胰腺，肠和骨髓等可以被诱导分化为胰岛素分泌细胞。结果表明胚胎干细胞具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能，但是这些细胞用于治疗糖尿病存在伦理问题和成瘤性的风险。胰管，腺泡以及胰岛中的非细胞同样显示出具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能。相比于其他细胞和组织，由于胰腺和肝脏在胚胎发育中起源于内胚层的相邻区，肝脏与胰腺在发育过程中具有共同的祖细胞，两者有很多相同的表观基因组，因此，肝脏被认为是诱导胰岛素分泌细胞的一个潜在的来源，诱导肝细胞向胰岛细胞的转分化过程中，能较少地改变表观基因。此外，肝脏具有强大的自我再生能力。肝脏在受到机械性或化学性损伤后会进行高效的自我修复，同时在修复的过程中，肝脏始终保持良好的功能。良好的再生能力为将肝脏多次诱导为胰岛细胞提供足够的细胞来源。肝脏参与血糖的代谢和调节，细胞表面存在血糖感受装置，是较为理想的异位诱导胰岛素分泌细胞(IPCs)的器官。2.3.2通过关键胰腺转录因子的表达诱导替代细胞许多以前的研究证明，利用病毒载体介导的多种胰腺转录因子（PTFs），可以使肝细胞重编程转化为胰岛素分泌细胞（IPCs）。PDX-1在胰腺发育，细胞分化以及激活胰岛素基因转录方面具有关键性作用。MafA作为一个最近被确立的细胞特异性转录因子，是胰岛素基因转录高效的激活剂。这些关键胰腺转录因子在非细胞（组织）中（如胰腺非细胞，肝，肠，骨髓细胞）的过度表达可诱导不同细胞相关基因的表达，其中包含胰岛素基因。人们对病毒介导的胰腺相关转录因子治疗糖尿病进行了大量的体内和体外研究，Ferber 等用第一代腺病毒载体（FGAd）将PDX-1基因和编码-半乳糖苷酶的基因导入注射过STZ两日后的小鼠肝脏中15，这项实验终止于8天之后，相比于FGAd-半乳糖苷酶，FGAd-PDX-1引起了血糖的明显降低。此外，在PDX-1治疗的小鼠中发现了血清胰岛素增高，并在肝内发现胰岛素阳性细胞。Kojima等人的最近一项报告证实：通过递送胰岛特异性转录因子在肝中诱导内分泌细胞是可行的16。Kojima等人向STZ诱导的糖尿病小鼠肝脏中递送的两种转录因子基因，PDX-1和Beta-2（又名Neuro D），在实验中他们使用辅助病毒依赖型腺病毒载体（helper-dependent adenovirus，HDAd）替代FGAd来递送基因，降低了病毒载体的毒性和宿主细胞中的免疫反应。3.糖尿病基因治疗的关键基因越来越多的实验数据表明在体外和体内用病毒载体将关键胰腺转录因子基因导入肝细胞，可以重新编码肝细胞，使其变为可以维持糖尿病动物葡萄糖稳态的胰岛素分泌细胞，这也成为了糖尿病基因治疗的主要方法。众所周知，胰腺的发生、发育和细胞分化过程中，有多种转录因子参与，在这些转录因子中，PDX-1对于胰腺发育，细胞分化以及激活胰岛素基因转录是至关重要的。Ngn3和NeuroD对于胰腺内分泌细胞的分化同样重要。MafA的表达发生于细胞分化的最后阶段，并作为胰岛素基因转录的强效激活剂。这一过程被认为是转录因子级联激活和不同基因的顺序表达，导致了不同类型胰腺细胞的发生和发育。在糖尿病基因治疗中，PDX-1，Ngn3，NeuroD和MafA这四个基因受到广泛关注。3.1 PDX-1在胰腺发育和细胞分化中起决定性作用在胚胎发育的早期阶段，当前肠内胚层向普通的胰腺前体细胞发育时，PDX-1最初表达于内脏部位。在胰腺发育过程中，PDX-1在前体细胞中持续表达，并且共表达一些与胰腺相关的激素，部分细胞最终分化为成熟的细胞。有证据显示PDX-1（+/-）小鼠葡萄糖耐量减低，伴有胰岛细胞死亡，胰岛团块减少以及异常的胰岛结构，这说明PDX-1的基因剂量对于维持葡萄糖稳态是至关重要的。据报道PDX-1-VP16而不是野生型PDX-1可高效诱导肝中胰岛素分泌细胞。此外，结果表明PDX-1-VP16可高效诱导肝中胰岛素基因表达，尤其是在胰腺转录因子NeuroD 或者Ngn3存在的情况下17。PDX-1-VP16与NeuroD 或Ngn3联合应用，对胰岛素分泌的增加和葡萄糖耐量的提高效果显著，揭示了这个组合可以有效且高效地替代糖尿病中胰岛素生物合成的减少，同时PDX-1需要同等功能的转录因子或者辅酶因子的补充来充分发挥它的功能。3.2 MafA作为一个最近新确定的胰腺转录因子，具有高效激活胰岛素基因的功能3.2.1 MafA基因的概述以前的结果表明，一个未被确认的细胞特异性核因子可结合到胰岛素基因增强子区域中一个被称为RIPE3b1的保守的顺式作用元件上，它很可能是胰岛素基因重要的反式激活因子18。最近，这种重要的反式激活因子被认为是MafA，一个基本的亮氨酸拉链转录因子。MafA蛋白属于巨噬细胞激活因子（Maf）家族，由一个包含N末端的酸性转录激活域的大Maf蛋白和三个只包含亮氨酸拉链转录因子的小Maf蛋白组成。 3.2.2 MafA在胰岛素分泌中的调节作用MafA通过一个被称为RIPE3b1的顺式作用元件控制胰岛素基因的细胞特异性表达，同时它也是胰岛素基因的强有力的反式激活因子。在胰腺发育过程中，MafA基因的表达首次出现于胰岛素分泌细胞产生的主要阶段的早期，同时其他重要的转录因子如PDX-1和NeuroD表达于胰腺发育的早期阶段。此外，当PDX-1和NeuroD同时表达于胰岛的不同类型细胞中时，MafA仅表达于细胞，且可以作为胰岛素基因转录的强效激活剂。基于MafA调节胰岛素分泌的作用，目前有两种基本观点：（1）在MafA(-/-)小鼠中，insulin1, insulin 2的转录明显减少，说明MafA对于体内胰岛素基因转录是一个至关重要的调节因子。（2）MafA缺失对于胚胎时期的胰腺发育影响不大，这可能与MafA表达于胰腺发育的最后阶段有关。相反，PDX-1和NeuroD的缺失导致胰腺发育障碍。最近证实MafA与一些其他的胰腺转录因子共同作用可高效诱导肝中胰岛素基因表达。MafA、PDX-1和NeuroD共同作用时可大幅度增加胰岛素启动子活性。这些结果证实MafA，PDX-1和NeuroD在胰岛素启动子活性方面表现出强大的协同效应。4.糖尿病基因治疗的载体4.1 腺病毒载体（AD）腺病毒属于DNA病毒家族，同时拥有线性双链基因组，因其强大的外源基因携带能力和转染分裂或非分裂细胞的能力，故成为基因转导的常用工具。腺病毒基因组具有4个区域，依次为E1-E4，分别与病毒复制，编码病毒多肽及细胞基因表达，表达主要组织相容性复合物，抑制细胞程序性凋亡等有关19。Ferber 等用第一代腺病毒载体（FGAd）将PDX-1基因或编码-半乳糖苷酶的基因导入注射过STZ两日后的小鼠肝脏中取得了一定的疗效，在FGAd中E1被删除，从而防止病毒无限制复制，否则会摧毁接受的宿主。然而注射这种载体后，当它们用于向肝中递送基因时，受体动物常发展为严重的肝炎。此外，宿主将增加免疫反应，从而在治疗的数周内过早地终止转基因的表达，这些通过腺病毒重新编码程序的肝源性胰岛素分泌细胞通常被免疫反应迅速消除。考虑到这一点，Kojima等人使用辅助病毒依赖型腺病毒载体（helper-dependent adenovirus，HDAd）来递送基因。这种辅助病毒依赖型腺病毒载体（HDAd）删除了所有的病毒编码序列，仅保留了末端反向重复序列和包装信号序列20。在小鼠中它的毒性可忽略不计，在单次治疗后，由HDAd递送的转基因通常可表达数月，甚至终生。借助HDAd向STZ诱导的糖尿病小鼠的肝中递送PDX-1可导致局部血糖的暂时降低。由于HDAd载体仍然保留了病毒的衣壳蛋白，因此仍然存在宿主对载体的免疫反应，然而与早期载体相比，HDAd已经大幅度降低了免疫反应。4.2 腺相关病毒载体（AAV）腺相关病毒是细小病毒科的一种单链DNA病毒，无包膜，并且存在复制缺陷。我们通过去除野生型病毒的整个病毒编码区域改造出用于基因治疗的重组腺相关病毒载体。AAV的优点在于引起机体的免疫反应较小。腺相关病毒（AAV）重组体是一个更有希望检验肝源性胰岛素分泌细胞的自身免疫的载体，它能高效介导基因转移，且能使目的基因稳定表达，并具有较低的免疫原性。AAV载体可转染分裂细胞和非分裂细胞，使已分化的组织作为靶点，并允许动物模型中治疗基因产物长期表达21。Vijay Koya等人使用Stz诱导NOD/SCID小鼠建立糖尿病小鼠模型，通过门静脉注射AAV介导的目的基因(PDX-1-VP16,Ngn3) 至小鼠肝脏中，目的基因在肝脏中稳定表达，并产生肝源性胰岛素分泌细胞。为排除基因治疗过程中胰腺的影响，Vijay Koya等人对基因治疗后的小鼠实施了胰腺全切术，胰腺切除后，肝胰岛素分泌细胞可以独立维持血糖正常。他们的结果还表明非胰腺胰岛素分泌细胞可能具有与胰腺细胞类似的表面自身抗原分布，这些胰岛素分泌细胞对于致糖尿病免疫细胞引起的攻击和破坏是敏感的。因此，通过基因治疗重新编码程序的细胞替换和再生疗法，需要免疫辅助途径来抑制之前存在的自身免疫反应，消除或降低淋巴细胞对重新编码程序胰岛素分泌细胞的损伤。5.展望将非胰腺体细胞重新编码程序使之成为胰岛素分泌细胞被视为最有希望治愈1型糖尿病的策略之一。试验性的糖尿病基因治疗尚处于初级阶段。在近年的研究中，已经达到了以下的目标：1）通过使用重组的AAV载体已将病毒抗原的免疫原性降到最低。2）证明肝胰岛素分泌细胞具有葡萄糖反应性并且可以维持糖尿病小鼠的葡萄糖稳态。3)直接观察到肝胰岛素分泌细胞易受自身免疫攻击的影响。胰岛的发生、发育和分化是在多个基因的精准调控下完成的，继续寻找决定产生胰岛素分泌细胞的关键性基因或基因组合仍是目前的首要任务，目前的基因治疗手段还不能获得完全成熟的细胞，进一步明确细胞分化成熟的基因调控机制必将促进糖尿病基因治疗的发展和应用。目前将基因治疗应用于临床试验的主要限制因素是获得安全有效的基因转移载体，发展安全有效的基因转移载体成为全世界许多基因治疗实验室的主要目标。可以想象的是，随着载体开发的快速发展，加上胰岛新生方法取得的长足进步，将使我们在不远的将来，糖尿病的基因治疗从动物实验到应用于临床试验成为现实。参考文献1. van Belle T L, Coppieters K T, von Herrath M G. 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