SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量

SDSPAGE测定蛋白质相对分子质量,【目的要求】,学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。,【实验原理】,电泳带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。在一定的电场强度下，分子在凝胶介质中的迁移速率取决于分子的大小、构型和带电量的大小。PAGE聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和引发剂过硫酸铵(AP)的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。,PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。,SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。,【SDS-PAGE基本原理】,强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。,蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。,将已知分子量的标准蛋白质在SDS-PAGE中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。,当蛋白质的分子量在17,000165,000之间时，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系：lgMW=K-bm,【操作方法】,、制胶玻板的清洗,用海绵和洗涤剂轻柔地清洗，严禁使用刷子和颗粒状的去污粉与洗衣粉，完全冲洗干净后烘干。,【操作方法】,2、垂直板电泳槽,1）分离胶的制备配制12%分离胶。在烧杯中依次加入重蒸水3.35ml,分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl,pH8.8）2.5ml,10%SDS0.1ml,凝胶储备液4.0ml，10%过硫酸铵50ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，留出梳齿的齿高加1cm的空间停止灌胶，小心覆盖一层蒸馏水，37烘箱下聚合（约30min）。待分离胶聚合完全后，除去覆盖的蒸馏水。,3、凝胶的制备,2）浓缩胶的制备配制5%浓缩胶。在烧杯中依次加入重蒸水2.92ml,浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl,pH6.8)1.25ml,10%SDS0.05ml,凝胶储备液0.8ml，10%过硫酸铵25ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝胶即开始聚合，所以应立即混匀混合液，用移液枪抽取凝胶液加至长、短玻璃板间的窄缝内，灌满后小心插入梳齿，避免混入气泡，37烘箱下聚合（约30min）。,4、蛋白质样品的处理,1）标准蛋白质样品的处理低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制剂MW=20,100鸡蛋清溶菌酶MW=14,400开封后，沸水浴中加热3-5min后上样。,2）样液的准备用移液枪小心吸取处理好的血清50ul至1.5ml的离心管中，再加入50ul上样缓冲液，混匀后沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。,将电泳仪的正负极与电泳槽正负极相连接，打开电泳仪开关，设置电压为200V，电泳60mins,此时溴酚蓝染料达到凝胶底部，停止电泳，关闭电源。,6、电泳,5、加样,用移液器分别取5l样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。,8、结果处理,量出加样端距细铜丝间的距离(cm)以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离(cm)，按下式计算相对迁移率mR：相对迁移率mR=,蛋白质样品迁移距离(cm)溴酚蓝区带距加样端距离(cm),7、染色与脱色,电泳结束后，取下玻板，在自来水下用特制板撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。加入染色液染色60mins，再用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。,【思考题】,1、在上样缓冲液中