分析化学-高效液相色谱.ppt

3-1概述,HPLC是60年代在GC和经典液相色谱基础上发展起来的。GC柱效高，且能分离、定量，但有些热稳定性差，不易挥发的组分不能用GC直接分析，人们想到模仿GC，用细颗粒固定相，薄壳固定液，以增加柱效。模仿LC用液体作流动相，在室温下进行，但阻力太大，液体流动相难以通过，所以又想到加高压泵，加快流动相流速，这样即增加了柱效，又加快了分析速度，也拓宽了应用范围，把柱子、高压泵、检测器配成仪器，就形成高效液相色谱仪。,HPLC与LC的比较LCHPLC柱径12cm25mm颗粒150200m510m压力常压高压tR120h1h内n250105/米用途初步分离高效分离、高灵敏度定量装置非仪器化精密仪器，自动化.智能化HPLC优点：柱效高分析时间短可定量仪器分析,HPLC与GC的比较GCHPLC流动相gl温度高温室温组分易挥发、热稳定性好不受限制可测有机物20%75%80%tR130min160min灵敏度10-1210-14g/ml10-910-11g流出物不易收集易收集HPLC优点：应用范围广，组分易回收,GC与HPLC选择：小分子热稳定性好GC大分子热稳定性差HPLC,二.HPLC法的特点：1.高效分离n=105/米2.高速使用高压泵，出峰时间几分钟到几十分钟3.高灵敏度检测下限：10-910-13g（最小检测量）4.自动化程度高（仪器分析、电脑控制、色谱工作站）5.应用范围广可测有机物75%80%,一.HPLC法的分类,二、高效液相色谱法的特点featureofHPLC,特点：高压、高效、高速、高灵敏度高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,分配系数K=组分在固定相中的浓度/组分在流动相中的浓度=CS/CM分配系数的差异是所有色谱分离的实质性原因,3-2影响分离的因素factorsinfluencedseparation,1.影响分离的因素与提高柱效的途径在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。,液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,2.流速,流速大于0.5cm/s时,Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。,3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。,高效液相色谱仪由五大部分组成：高压输液系统进样系统分离系统检侧系统记录及数据处理系统分析流程：,HPLC仪器详解,一.高压输液系统1.高压输液泵：恒压泵（流量随阻力变化重现性差）恒流泵（多用）：往复式注射式,作用：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统。性能：有足够的压力输出流量恒定，可调输出压力平稳泵室体积小泵体抗腐蚀、耐酸,2.梯度洗脱装置作用：将两种或两种以上溶剂按一定程序连续改变配比，以改变流动相极性、离子强度、PH值、提高分离效率。低压梯度洗脱（常压混合，高压进柱，1个泵。）高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）,二.进样系统注射进样：装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。六通阀进样：目前最常用，由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。,图12-5六通阀进样示意图a载样(样品进入定量管)b倒阀(样品导入色谱柱)1定量管2样品进入口3流动相进口4色谱柱,1.载样管,三.分离系统：色谱柱不锈钢直型分析：内径26mm长1030cm制备：内径1025mm长1550cm恒温器：电热恒温装置（室温150）恒温水浴类套（70以下）作用：保证分析时温度恒定，否则对tR影响较大,四.检测系统1.紫外可见光度检测器：固定波长：254nm，低压汞灯。可调波长：190800mm，钨灯，氘灯。光电二极管矩阵检测器：190700nm。,光电二极管矩阵检测器特点：灵敏度高、分辨率好、方便、快速、准确，可扫描得三维流出曲线紫外检测器的应用：对紫外有吸收的组分，且吸光度与浓度成正比。紫外检测器的特点：灵敏度高最小检测浓度10-9g/ml线性范围宽对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱应用范围广,快速扫描光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图,2.荧光检测器：多波长荧光检测器（滤光片）荧光分光检测器（光栅分光）氘灯作激发光源，波长范围250600nm应用：组分吸收一定波长紫外光后发射荧光的物质，且荧光强度与浓度成正比。特点：灵敏度更高检测限10-1210-13g/ml（灵敏度比UV检测器高23个数量级）选择性好对温度和流速不敏感，可进行梯度洗脱所需试样量少，适于痕量分析应用范围广3、电化学检测器电导、库仑、极谱、安培、电位等检测器。,一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph,3-3主要分离类型与原理,basicprincipleandmainseparatingtypes,一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。,三、离子交换色谱ion-exchangechromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,四、离子色谱ionchromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。,五、离子对色谱ionpairchromatography,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。,六、排阻色谱size-exclusionchromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,七、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,一、液相色谱固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色谱流动相mobilephaseofHPLC,3-4液相色谱的固定相与流动相,stationaryphaseandmobilephaseofHPLC,一、液相色谱固定相stationaryphasesofLC,1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；,（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为12m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；,（3）化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOCb.硅氧硅碳键型：SiOSiC稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：SiCd.硅氮键型：SiN,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；,存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：510m；,3.离子交换色谱分离固定相,结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）,4.空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。,二、液相色谱的流动相mobilephasesofLC,1.流动相特性（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮二氧六环四氢呋喃甲乙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚异丙醚二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,第五节应用实例（一）环境样品分析水中酚类化合物测定C8柱；流动相：A(1.0%醋酸水溶液)和B(1.0%醋酸乙腈溶液)进行梯度洗脱，B由30%100%；（20min),1.2ml/min;光电二极管矩阵检测器.,图127十一种酚的色谱图1苯酚24一硝基苯酚32一氯苯酚42一硝基苯酚52，4二硝基苯酚62，4一二甲