中检所-菌种及基本技术.ppt

药品微生物检验基本技术,中国药品生物制品检定所马仕洪2010年,website:e-mail:mashtel地址：北京市天坛西里2号邮编：100050,中国药品生物制品检定所,2,药品微生物检验基本技术,1、认识微生物2、微生物分离3、微生物培养4、微生物鉴别5、溯源性分析6、保藏与应用7、安全与防护8、消毒与灭菌,中国药品生物制品检定所,3,1、认识微生物,微生物定义原核生物与真核生物细菌与真菌（霉菌及酵母菌）需气菌与厌氧菌,中国药品生物制品检定所,4,1、认识微生物,药品微生物检验常用标准菌株枯草芽孢杆菌BacillussubtilisCMCC（B）63501金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC（B）26003生孢梭菌ClostridiumsporogenesCMCC（B）64941铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaCMCC（B）10104大肠埃希菌EscherichiacoliCMCC（B）44102白色念珠菌CandidaalbicansCMCC（F）98001黑曲霉AspergillusnigerCMCC（F）98003,中国药品生物制品检定所,5,1、认识微生物,菌种编号CMCC中国医学菌种保藏中心CMCC（F）或CMCC（B）B代表细菌、F代表真菌ATCC美国标准菌种收藏所著名的微生物保藏中心，创立于1899年，设在美国马里兰州罗克维尔市。收藏有细菌、真菌、动植物病毒、噬菌体、藻类和原生生物等共计16000株以上的微生物种株。,中国药品生物制品检定所,6,1、认识微生物,微生物的生长（populationgrowth）与代时（generationtime）不同微生物的代时范围是20min10h大肠埃希菌：20min枯草芽孢杆菌：28min金黄色葡萄球菌：30min铜绿假单胞菌：35min大肠埃希菌20min繁殖一代，繁殖13h后，其子代细胞数可以达到11013个（约等于人体全部细胞数），培养24h后子代细胞数则可以达到4.71021个,中国药品生物制品检定所,7,1、认识微生物,微生物分布药品中的微生物,中国药品生物制品检定所,8,2、微生物分离,微生物收集气体环境：气体采样仪液体环境：直接接种、薄膜过滤固体环境：触皿、搽拭、洗涤与匀浆微生物分离,中国药品生物制品检定所,9,3、微生物培养,培养条件培养基培养温度需氧与厌氧培养目的增菌培养纯培养鉴别培养,中国药品生物制品检定所,10,平板划线分离法,斜面接种时的无菌操作,中国药品生物制品检定所,11,4、微生物鉴别,培养形态微观分析生化鉴定DNA鉴定,BIOLOGGenIIIMicroStation自动快速微生物鉴定仪,革兰染色液套装与bioMrieux微生物鉴定试剂盒,中国药品生物制品检定所,12,5、溯源性分析,相似性分析,BRUKERTENSOR27/HTS-XT傅立叶变换红外光谱(FTIR)微生物分析系统,中国药品生物制品检定所,13,6、保藏与应用,样品分离菌库环境监控菌库标准菌种菌库标准菌种的保藏与应用使用频繁传代限制（5代）,中国药品生物制品检定所,14,标准菌种的保藏与应用,干菌种(安瓿)的开启：,中国药品生物制品检定所,15,标准菌种的保藏与应用,菌种保藏及应用参考方法：干菌种（0代）100ml液体培养基复苏（1代）100ml液体培养基复壮（2代）加100ml20%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装，-20或-80保存每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（3代）,注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！,中国药品生物制品检定所,16,标准菌种实验用菌液,菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。,中国药品生物制品检定所,17,标准菌种实验用菌液,参考菌液制备标准程序：取经35培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用（枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌10-6、铜绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7）；,中国药品生物制品检定所,18,标准菌种实验用菌液,参考菌液制备标准程序：取经35培养1824小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用；,中国药品生物制品检定所,19,标准菌种实验用菌液,参考菌液制备标准程序：取经25培养1824小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用；,中国药品生物制品检定所,20,标准菌种实验用菌液,参考菌液制备标准程序：取经25培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。,中国药品生物制品检定所,21,标准菌种实验用菌液,关于黑曲霉：,转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作；置2328培养57日，培养斜面形态可参照下图；转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121湿热灭菌30分钟再作处理；,中国药品生物制品检定所,22,标准菌种实验用菌液,关于黑曲霉：,黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于40.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。,关于新鲜培养物（USP31/Chp2010）：,制备的菌液应在2小时内使用，保存在28的菌液可以在24小时内使用。对于具有稳定的孢子形态的黑曲霉和枯草芽孢杆菌，作为使用新鲜培养物稀释液的替代方法，可以使用孢子储备液，在验证过的期间内，其稳定的孢子储备液可以保存在28一直使用。,中国药品生物制品检定所,23,关于黑曲霉,图15黑曲霉（Aspergillusniger）CMCC（F）98003改良马丁琼脂斜面典型斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于40.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。,中国药品生物制品检定所,24,关于黑曲霉,第2天,第34天,第45天,第57天,图14黑曲霉改良马丁琼脂斜面不同培养时间的生长形态,中国药品生物制品检定所,25,关于黑曲霉,一类新药IMM018,中国药品生物制品检定所,26,标准菌种实验用菌液,菌液检验：结合验证实验方法进行活菌计数。生孢梭菌可在同步硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度实验中计数。,中国药品生物制品检定所,27,7、安全与防护,洁净实验室PII级生物安全实验室生物安全柜,中国药品生物制品检定所,28,8、消毒与灭菌,消毒消毒是指对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物。所以消毒是不彻底的，不能代替灭菌。凡用于消毒的化学药品称为消毒剂(disinfectant)。消毒剂有液态、固态和气态。消毒剂按其杀灭微生物的能力一般分三级：高效消毒剂-指可杀灭所有种类微生物（包括细菌芽孢）的消毒剂，如戊二醛、过氧乙酸等；中效消毒剂-指可杀灭细菌繁殖体（包括结核杆菌）、大多数种类的病毒与真菌（不包括细菌芽孢）的消毒剂，如乙醇、氯代二甲苯酚等；低效消毒剂-指可杀灭大多数细菌与一些种类的病毒和真菌（不包括结核杆菌和细菌芽孢）的消毒剂，如氯己定、苯扎溴铵等。,中国药品生物制品检定所,29,8、消毒与灭菌,灭菌凡能杀灭物体中所有活的微生物的作用称为灭菌。灭菌的手段，称为灭菌法。灭菌的设备，称为灭菌器。准确地讲，灭菌法是指用适当的物理或化学手段将物