2015年生物工程下游技术复习

生物工程下游技术一、 名词解释（每题4分，共20分）1、 连续培养反应器：不断地往反应器中加入营养物，利用罐中的菌体增殖得到产物，并不断采出。在良好的控制下，罐内菌体的增殖速度可以与采出速度相同而达到稳态。2、 菌体比生长速率：单位浓度菌体在一定条件下引起的反应速率, 其值反映了培养菌体的活力, 受菌株及各种物理化学环境的影响. 表示为=dx/x.dt、qs=-ds/xdt、qp=dp/xdt3、 得率系数：两种物质得失之间的计量比,符号Y4、 贴壁培养: 贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.5、 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。6、 浓差极化：指在分离过程中，料液中的溶剂在压力驱动下透过膜，溶质被截留，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高。在浓度梯度作用下，溶质由膜面向本体溶液扩散，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶剂透过量下降。溶剂向膜面流动引起溶质向膜面的流动，这种流动如果与浓度梯度所驱动的溶质向本体溶液扩散的速度平衡时，在膜面附近就形成一个稳定的浓度梯度区，这一区域就称为浓度极化边界层，这一现象称为浓差极化。浓差极化是一个可逆的过程；7、 膜污染：物料中的微粒、胶体粒子或溶质大分子由于与膜存在物理化学相互作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸、沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化的现象。8、 排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。9、 分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。 10、 有效柱长（有效迁移距离，Leff）：不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线性流速时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献，而当其迁移速度等于流动相速度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离称为有效迁移距离，也称为有效柱长。11、 吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。12、 切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。（实际是维持了c).目前几乎所有的膜固液分离都采用切向流方式13、 包含体（包涵体，inclusion bodies):存在于基因工程细胞中，主要由蛋白质构成，其中大部分是克隆表达的产物，这些产物在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物学活性。难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。14、 蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。15、 切向流过滤（错流过滤、交叉流过滤、十字过滤）：就是一种维持恒压下高过滤速度的技术，其原理就是：使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用液体的剪切作用将介质表面的固体移走，当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。16、 双水相萃取：利用被提取物在二相中的分配不同而实现分离的目的；由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。17、 反渗透：在高于溶液渗透压的压力作用下，只有溶液中的水透过膜，而所有溶液中的大分子、小分子有机物及无机盐全被截留。理想的反渗透膜应被认为是无孔的，它分离的原理是溶解扩散（或毛细孔流学说）。18、 分配系数：组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示19、 色谱曲线基线：无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。20、 保留值：试样中,个组分在色谱柱中的滞留时间,由色谱分离过程中的热力学因素控制,作定性参数21、 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。22、 死时间（tM）：不与固定相作用的溶质，如所相色谱中气体（如空气）的保留时间。23、 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM 24、 容量因子k：平衡时，组分在各相中达到平衡时总的质量比25、 离子交换色谱：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关，随着流动相的pH值及置换剂浓度的变化而变化。26、 排阻色谱：按组分分子大小进行分离的一种色谱。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。27、 亲和色谱：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。28、 正相色谱：亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。29、 反相色谱：若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。30、 非线性色谱: :当组分的进样量达到一定的水平时，Cm与Cs不存在线性关系的色谱， 一般是制备型色谱。31、 吸附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。32、 全交换容量:每克干介质或每毫升湿介质具有的功能基含量.是一个定值.33、 工作容量:每克干介质或每毫升湿介质在一定的操作条件下的交换吸附蛋白质的实际容量.是一个变值.34、 疏水性色谱:填料表面具有弱疏水性,蛋白质的疏水基团与填料表面之间产生弱的疏水性相互作用.高浓度的盐条件下,蛋白质与疏水固定相的吸附能力高,随着盐浓度的下降,吸附能力下降.当淋洗液离子强度逐渐降低时,蛋白质样品按其疏水性的不同依次被洗脱.35、 径向色谱：采用径向流技术的色谱,即样品和流动相沿径向流动,可以从色谱柱的周围流向圆心,也可以从圆心流向柱的周围.通常采用从柱的周围流向圆心的方式.36、 泳动度(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度 即:U=V/E=(d/t)/(V/L)37、 变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进生38、 非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂39、 高压均浆法：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。40、 线性色谱:在色谱学中,如果流动相中样品的浓度与固定相中的样品浓度之间是线性关系,那么这种情况下的色谱分配过程就称为线性色谱41、 生物过程动力学:定量地描述过程的速率以及影响过程速率的诸多因素.包括细胞生长速率、各种基质消耗的速率、代谢产物的生成速率。42、 悬浮培养：是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程.主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等.43、 固定化培养：利用吸附或包埋等固定化的方式将细胞限制在一定的空间内,然后以固定化的颗粒进行悬浮培养.该方法对贴壁性和非贴壁依赖性细胞都是适合的.44、 膜分离技术：以半透膜为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中的其他组分，从而达到分离目的的技术。45、 离子交换法：通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法。主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。46、肽谱：指蛋白质被酶解或化学降解后肽段的分离分析或制备。二、填空题（共20分）1. 超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。2. 目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种: 微孔过滤(微滤)、超滤、 反渗透。3. 在生物工程下游技术领域， 色谱 和 电泳 是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。4. 在生物物质分离中，可以依据一次进样量多少，将色谱分为： 分析色谱、 半制备色谱（中等规模制备色谱）、制备色谱 和工业生产规模色谱 4大类。5. 无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装置均应包括: 流动相供给、 进样、 色谱柱、 检测器 等四大部分。6. 在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法： 一种是维持流动相热力学参数不变的 等梯度洗脱法，另一种叫 梯度洗脱法。7. 径向色谱填料主要有： 离子交换树脂 和 亲和色谱填料 两种。8. 评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括：（每空0.5分） 保留值 ， 选择性 , 柱效率 , 填充柱的空喜和穿透性 ,分离度 。9. 请列举任意四种破碎细胞的方法：（每空0.5分） 高压匀浆法 高速珠磨法 ，超声破碎 化学渗透法 。10. 在HPLC领域内经常可以遇到的吸附等温线可以有以下5种（形状）:（每空0.5分） 凹形 , 凸形 , S形 , H形 ， 阶梯形 。11. 羟其磷灰石在原理上一般被认为是一种 弱离子交换 色谱。（本小题1分）12. 请列举二种测量蛋白质含量的方法考马斯亮蓝法 ， 克氏定氮法 。（ 每空1分）。13. 常见的无机色谱填料主要包括： 硅胶 、 可控孔径玻璃 、 氧化铝 、 氧化钛 、 羟基磷灰石 以及 碳 和 石墨 等基质。14.15. 无机HPLC填料最常见的是以 多孔硅胶 为基本材料的填料；含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的 Na2O-B2O3 相及不溶于酸的 高硅 相。将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是 二氧化硅 。 (每空1分)16. 不同分子量的蛋白质在电场中的迁移速度与其所带的 静电荷数 成正比，与它本身的 半径 及溶液的 粘度 成反比。(每空1分)17. 溶质保留置换理论的核心是： 当一个溶质被吸附剂西湖时,在溶质份子和吸附剂接触的表面必然会释放出一定数目的溶剂分子 。(本小题3分)18 指出三种交联葡聚糖的微载体：Cytodex1微载体；Cytodex 2微载体；Cytodex 3微载体19 指出蛋白质复性的三种方法：稀释法，透析法，液色色谱法等20固液分离的主要方式包括：离心法，过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。21膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜22 色谱的保留值可以用保留时间也可以用保留体积来表示。23色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。24指出下列情况下色谱系统对容质的柱效和分配系统差的关系： 柱效较高，K (分配系数)较大,完全分离； K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低，K 较大,但分离的不好； K 小，柱效低，分离效果更差。25线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。26Shepadex G25是一种凝胶排阻色谱，主要用于脱盐。27Shephadex G100是一种凝胶排阻色谱，主要用于蛋白质的纯化。28DEAE-Shaphdex A25是一种离子交换层析介质。29CM-纤维素是一种弱阳离子交换介质。30离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。31QAE-葡聚糖是强碱阴离子交换剂，SP是强酸阳离子交换剂。32目前径向色谱柱使用的填料主要有离子交换树脂和亲和色谱两种;33蛋白质含量和纯度测定方法。含量测定:克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。纯度衡量:电泳法，层析法，质谱法等。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。34细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：液体剪切力和固体剪切力方法，液体剪切力包括：高压匀浆法和超声破碎法；固体剪切力包括：高速珠磨法和压榨法。35高压匀浆法的主要困难包括：温控和堵塞问题36高压匀浆法的破碎率决定于：匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。37l 蛋白质的分子量测定：超离心法：l 光散射方法：l 凝胶过滤法：测定完成蛋白质分子的分子量。SDS-PAGE电泳法：是基于在SDS的存在下，蛋白质表面都携带了大量负电荷而呈杆状分子，在此情况下，根据其分子形状和大小进行分离。测定蛋白质亚基的分子量，与凝胶过滤法一起用，测定用蛋白质分子量，可以方便的判断样品蛋白质是否为寡聚蛋白质。38、HPLC色谱柱的关键在于填料39、凝胶填料主要类型：多糖类和高聚物型40、泳动度(迁移率)取决于带电质点的性质，即质点所带的净电荷的量、质点的大小和质点的形状。同时决定于：电泳介质阻力、溶液黏度.41、两性的生物大分子所带电荷的性质和数量由其等电点及溶液环境(pH值)所决定;42、生物物质分离的主要技术手段：细胞破碎、固液分离、膜分离、层析技术、电泳技术三、是非题（请将答案填在下表中相应的题号下面，对的打“”，错的打“”，每题1分，共 10分）题号12345678910答案1. 错 微波加热法破碎细胞特别适合于对热(不)稳定的的产物的提取。2. 对 凝胶过滤操作中，通常上样量越小，分辨率越高。3. 对 利用液相色谱方法对包含体蛋白质进行复性比稀释复性法优越.4. 对 一旦液料开始与膜接触，膜污染就开始发生。5. 对 浓差极化是一个可逆的过程。6. 错 膜污染是一个可逆的过程。7. 对 层析系统中,有效柱长最短柱长是使最难分离的一对溶质将达到完全的基线分离的必要条件.8. 对 层析系统中,当实际柱长最短柱长, 则该分离过程不能达到物质的有效分离.9. 对 层析过程中,有效柱长是随层析条件的变化而变化的.10. 对 层析过程中,可以通过改变洗脱剂的浓度变化梯度改变有效柱长和最短柱长.11. 错 分析色谱是线性色谱；12. 错 制备型色谱是非线性色谱。13. 对 只要样品进样量足够大，色谱过程就是一种非线性色谱。14. 对 非线性色谱的保留值是可变的，峰形是不对称的，峰高与样品量不成正比关系15. 错 生化用离子交换树脂的电荷密度越大，其分离效果越好。16. 对 HPLC填料的颗粒粒度的分布应该是越小越好的，最好是能实现颗粒的单分散。17. 错 样品中蛋白质的纯度为99%，说明该样品中目标蛋白质的含量为样品总量的99%。18. 对 实验室可以使用SDS-PAGE电泳测量蛋白质的分子量。19. 错 所有的蛋白质电泳都是利用不同蛋白质带的电荷的差异而达到分离不同蛋白质目的的。20. 错 硅胶在pH114的范围内都很稳定，因此适合于在极端pH条件下的离子交换色谱。21. 错 葡聚糖凝胶排阻色谱中，上样量越大，分辨率越高。22. 对 同一蛋白质在不同种类的缓冲液中，只要缓冲液的pH值相同，则蛋白质所带的电荷数量也相同。23. 错 凝胶排阻色谱的层析柱越长越好。24. 错 细胞破碎过程应尽量彻底，使细胞碎片尽可能越小越好。25. 对 HPLC填料的颗粒分散范围越窄越好。26. 对 利用聚赖氨酸/海藻酸系统进行的细胞微囊化培养，所形成的微囊外膜的孔径的大小主要是由聚赖氨酸的分子量所决定的。27. 对 非线性色谱的样品的保留值是可变的.28. 错 非线性色谱的层析峰形一般来说是高斯正态分布的对称峰.29. 对 为了减小样品在洗脱过程的轴向扩散，可采取增大进样浓度减少进样量的方式。30. 错 动物细胞培养一定要采用贴壁培养的方式。31. 错 作为动物细胞培养的优良微载体应该是刚性的。32. 对 动物细胞培养微戴体的密度应略大于培养基；33. 错 高速珠磨法比高压匀浆法破碎细胞的效果好。34. 对 一般讲，亲水性膜及膜材料电荷与溶质相同的膜较耐污染。35. 对 色谱过程中试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础36. 对 色谱过程一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢37. 对 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。38. 对 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。39. 错 色谱柱效高说明该色谱对物质的分离度高40. 错 分离度是由色谱柱的柱效所决定的41. 错 分离度是由色谱柱的分配系数所决定的42. 错 分离度是由色谱的容量因子所决定的43. 对 分离度由色谱柱的柱效率和物质间的分配系数的差异共同决定。44. 错 分析色谱是线性色谱;制备色谱属于非线性色谱。45. 错 在凝胶排阻层析中，流动相的速度越慢越有利于色谱分离和分析。46. 对 无机高效液相色谱填料主要是以多孔硅胶为基本材料,还有可控孔径玻璃,氧化铝,氧化锆,羟基磷灰石,碳和石墨等.47. 对 两性的生物大分子所带电荷的性质和数量由其等电点及溶液环境(pH值)所决定;48. 对 聚丙烯酰胺浓缩胶的原理包括其pH值=6.9为甘氨酸的等电点。49. 对 SDS-PAGE电泳的迁移率主要由分子量决定，分子量小的移动快。50. 对 SDS-PAGE中SDS的作用是消除蛋白质间的电荷差异，也消除了分子间形状的差异。51. 对 样品溶解不好容易造成拖尾52. 错 Monod常数随菌体的浓度的变化而变化？53. 对 Monod常数是细胞培养过程中的一个对菌体性质的特征性常数。54. 错 色谱柱效可从峰宽得到，色谱峰越宽，柱效越低，峰宽相同，柱效相同？55. 错 决定柱效的因素是分配系数。56. 错 决定柱效的因素是容量因子。57. 错 理论塔板数越多，柱效越高。58. 错 可以说“A柱子的柱效高于B柱子。”59. 错 分配系数与柱效没有关系？60. 对 容量因子与柱效有关系？61. 对 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果62. 对 用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质63. 错 微囊化不会使传质效率受影响（微囊化的缺点：传质效率受到影响）64. 对 生物反应器的放大要解决的主要问题是由传质效率的限制引起65. 错 气相色谱法适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。66. 对 一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢。67. 错 细胞破碎时破碎率越高越好。68.69.70.四单选题（请将正确答案的字母填在下表中相应的题号下面，每题1分，共10分）题号12345678910答案C1高效液相色谱设备最核心的部分是：（A）高压输液系统；（B）高灵敏的检测系统；（C）高效的层析柱。A2分析型色谱一般是：（A）线性色谱；（B）非线性色谱；（C）离子交换色谱A3DEAE-Sephadex A25是一种：（A）离子交换色谱填料；（B）凝胶排阻色谱填料；（C）亲和色谱填料C4颗粒表面主要含C18、C8基团的色谱填料适合作为：（A）离子交换色谱填料；（B）正相色谱填料； （C）反相色谱填料B5下面关于高速珠磨法和高压匀浆法破碎细胞的提法哪种是正确的？（A）高速珠磨法比高压匀浆法更优越；（B）高速珠磨法和高压匀浆法各有优点；（C）高压匀浆法比高速珠磨法效率更高；A6多孔硅胶分子中最常见的硅羟基是：（A）单硅羟基；（B）二硅羟基；（C）三硅羟基；B7羟基磷灰石是一种：（A）有机色谱填料；（B）无机色谱填料；（C）亲和色谱填料C8符合下面什么条件时的层析方案是不可行的：（A）最短柱长最短柱长;(C) 最短柱长有效柱长A9. 利用生物物质生物功能的差异进行分离的是：(A) 亲和层析;(B) 离子交换层析；（C）羟基磷灰石层析1B0下面关于蛋白质纯度的提法哪个是正确的：（A）蛋白质纯度是指目标蛋白质占样品总量的百分比；（B）蛋白质纯度是指目标蛋白质占样品中总蛋白的质量百分比；（C）蛋白质纯度可以通过考马斯亮蓝法测定；D11关于细胞破碎方法，以下提法哪种是正确的：（A）细胞破碎是以破碎率为基准的；（B）高压匀浆法比高速珠磨法更加优越；（C）高速珠磨法比高压匀浆法更加优越；（D）高速珠磨法和高压匀浆法各有特点；A12. 在理想状态下,下列哪种色谱对二种物质的分离度可以随柱长的延长而无限增加:(A) 凝胶排阻色谱;(B) 离子交换色谱;(C) 亲和色谱;(D) 分配色谱;B13. 下列哪种色谱填料最适合做为径相色谱的填料:(A) 凝胶排阻色谱;(B) 离子交换色谱;(C) 疏水色谱;(D) 分配色谱;A14Sephadex G50是一种：（A）凝胶排阻色谱填料；（B）亲和色谱填料；（C）离子交换色谱填料；（D）吸附色谱填料。C15对于HPLC填料的颗粒大小，下列提法哪种是正确的：（A）制备型HPLC填料以小颗粒为佳；（B）HPLC填料的颗粒越大越好；（C）HPLC填料必须具有合适的颗粒大小和较窄的颗度分布；（D）颗粒大的HPLC填料的刚性比小颗粒HPLC填料的刚性好。D16下面哪种色谱填料是葡聚糖和琼脂糖交联的产物：（A）Sephaadex LH-20(B) Sepharose CL;(C) Sephasorb HP(D) Superdax;A17. 聚合物型基质材料中，下列哪种是应用最为广泛的：（A）交联聚苯乙烯树脂；（B）交联聚甲基丙烯酸酯类树脂；（C）羟基化聚醚树脂；（D）交聚聚乙烯醇树脂；D18对于硅胶而言，其表面的硅羟基是进行化学修饰的基础，硅胶表面的硅羟基的主要存在形式是：（A） 硅三羟基； （B） 硅二羟基；（C）邻位硅羟基；（D）单硅羟基；A19不经过化学修饰或改性的硅胶本身可以做为：（A）正相色谱填料；（B）反相色谱填料；（C）离子交换色谱填料；（D）亲和色谱填料；A20羟基磷灰石是一种：（A）弱离子交换色谱填料；（B）强离子交换色谱填料；（C）吸附色谱填料；（D）分配色谱填料；A21蛋白质电泳中蛋白质所带的净电荷主要是由以下哪种因素所决定的：（A）电泳缓冲液的pH值；（B）电泳缓冲液的类型；（C）电场的强度；（D）蛋白质分子本身的氨基酸组成；B22在保证电泳结果准确性的前提下，为了降低电泳过程的温度升高，以下哪种方式是最合理的：（A）降低电流和电压；（B）降低电流并适当提高电压；（C）降低缓冲液的离子强度；（D）提高电流强度并适当降低电压。D23下列方法哪种适合用于测量蛋白质的纯度：（A）考马斯亮蓝法；（B）克氏定氮法；（C）双缩脲法；（D）SDS-PAGE电泳法A24蛋白质提取得率主要由以下哪个阶段所决定（A）初级分离阶段；（B）精制分离阶段；（C）破碎细胞阶段；（D）各个阶段的影响差不多C25在蛋白质进取过程中进行细胞破碎的目的是：（A）追求最大的破碎率；（B）使细胞内容物全部释放出来；（C）使目标物质最大限度释放出来；（D）使下阶段的过滤阶段速度更快。B26超声破碎细胞的原理是：（A）固体剪切力；（B）液体剪切力；（C）非机械剪切力；（D）声波直接作用于细胞膜使细胞破裂。B27下列哪种色谱是利用生物物质的功能的不同进行分离的：（A）离子交换色谱（B）亲和色谱（C）反相色谱（D）正相色谱A28. 解决培养条件和最优化控制的困难的最好方法（A）灌注(B)换液(C)流加(D)以上三种效果都差不多D29、目前细胞培养产物的收率很低，不及总蛋白的1%，主要原因不包括： (A) 血清蛋白质的污染(B) 细胞表达产物浓度低 (C) 产物在培养条件下不稳定(D)分离技术限制B 30、生化用离子交换剂的特点不包括（A）粒径小，分布均匀 (B)疏水性(C)生物相容性(D)适当的电荷密度C31、微囊化使一下哪个受到消极影响（A）抗剪切力（B）细胞生长环境（C）传质效率（D）产物浓度A32、双水相萃取最困难的是（A）如何使需要的蛋白质尽量集中在上相（B）如何使需要的蛋白质尽量集中在下相（C）保持蛋白质稳定（D）防止蛋白质的空间结构受破坏五、综合题（共40分）1 试述非线性色谱的概念及其特点?非线性色谱: 流动相中的样品浓度(Cm)与固定相中的样品浓度(Cs)不呈线性关系的色谱.分析色谱大多属于线性色谱;制备色谱大多属于非线性色谱非线性色谱的特点. 样品的保留值可变:非线性色谱的保留值随样品及其浓度的不同而变化;. 峰形的不对称性:不是高斯正态分布的;. 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系:峰高增加的速率随浓度的增加而下降.2 什么叫吸附等温线?研究吸附等温线有什么意义?附等温线：指在一定温度下物质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系。研究吸附等温线可以提供得到以下方面的信息：. 预测代表该吸附等温线的组分在非线性色谱中色谱峰的形状；. 为非线性色谱分离与纯化物质选择最佳条件；. 反映被分离物质分子与固定相表面的作用，从而研究分子的构型及吸附状态。. 建立分子结构-吸附之间的定量关系，从而由分子结构预测吸附性能。3 做为优良的凝色谱介质应该具备什么基本特点?. 介质本身为惰性物质，不与溶质、溶剂分子发生任何作用；. 应尽量减少介质内含的带电离子基团，以减少特异性吸附，提高蛋白质的收率；. 介质内孔径大小要分布均匀，即孔径分布较窄。. 凝胶珠粒大小均匀；. 介质要有良好的物理化学稳定性及较高的机械强度，易于消毒。4 做为优良的HPLC填料应具备什么基本的物理化学特性? 在物理结构上的要求: 合适的颗粒大小及较窄的粒度分布; 一定的颗粒强度; 一定的孔径大小和孔径分布,避免复杂的微孔结构; 一定的溶胀及收缩水平;优良的HPLC填料目前的主要发展方向: 颗粒单分散的填料; 贯穿性超大孔结构的填料; 小颗粒的非多孔填料; 在化学结构上的要求:填料的化学结构,特别是颗粒表面和内孔表面的化学结构(如连接在基质上的官能基团或链段)是影响色谱热力学行为(保留值,选择性等)的主要因素 特定的选择性; 良好的化学稳定性; 避免不可逆吸附;5 试述对硅胶的硅羟基进行表面化学修饰的主要方式. 通过氯化反应：可以将硅羟基转化成硅氯基，硅氯基性质活泼可以与各种化合物反应而引入相应的基团。这种方法引入的基团是单分子层的，具有较好的传质能力和色谱性能，但成本较高。. 通过氯硅烷与硅羟基的反应：通过氯硅烷可以将各种烷基链引入硅胶表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯代型和三氯代型等。. 通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应：硅氧基硅烷与硅胶进行缩合反应，使硅胶表面带上环氧基或氨基等基团，在此基础上可以很方便地进一步进行反应或修饰。这一健合反应可以在水相，也可以有机介质中进行6 试述羟基磷灰石做为一种有广阔发展前途的色谱填料的主要特点.羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAP)是一种弱阳离子或弱阴离子交换层析材料.其材料本是骨骼和牙齿等生物硬组织的主要无机成分,与生物组织有特异性的亲和力和相容性.其优点是:能精确地分离,纯化结构上只有微小差别的生物大分子.做为一种优良的色谱填料,羟基磷灰石具有以下特点:. 高机械强度:可以耐受15MPa以上压力,陶瓷HAP可以耐受几十MPa的压力. 高柱效:球形HAP颗粒大小,形状及孔隙大小均适合HPLC的要求.其颗粒及孔径小,有比较高的柱效. 化学和热稳定性:是磷酸钙盐中最稳定的,在中性和碱性不相中非常稳定,溶解度很低,热稳定性很高,可采用高温制备方法生产. 低的非可逆性吸附:HAP有非常低的非可逆性吸附. 表面修饰性:HAP表面比较容易进行各种化学修饰. 总之HAP:高选择性,高键合容量,低的非可逆吸附,良好的化学和热稳定性.7 试述化学渗透法破碎细胞的原理及其优缺点?作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。 优点（相对机械破碎）： 对产物释出有一定的选择性； 细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取； 核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。 缺陷： 时间长，效率低； 化学试剂有毒； 通用性差8 与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：. 在进样后可很快的除去变性剂；. 色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；. 在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；. 便于回收变性剂，降低废水处理成本。9 在对包含体蛋白质进行增溶和复性的过程中为什么要加入还原剂,同时为什么还必须加入金属螯合剂?常用的还原剂有哪些?在复性后为什么要加入氧化剂?常用的氧化剂有哪些?（10分）10 什么叫双水相萃取?在双水相萃取中为什么要尽量将细胞碎片集中在下相?可以采取什么可能的措施在使细胞碎片尽量集中在下相的同时,使目标蛋白质尽可能集中在上相?（9分）11 什么是径向色谱?径向色谱应用于生物物质分离有什么优点?（7分）采用径向流技术的色谱，即样品和流动相沿径向流动，可以从色谱柱的周围流向圆心，也可以从圆心流向柱的周围。通常采用从柱的周围流向圆心的方式。径向色谱应用于生物物质分离的优点：采用径向流技术，可以在较小的柱床层高度时使用较大的流动相速度；在较高流动相速度时，反压降低；可以线性地增加样品处理量，样品可以在完全相同的色谱条件下直接放大。12 利用微载体进行动物细胞培养的优点有哪些？答：微载体培养的优点: 表面积/体积比大; 微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制; 培养基利用率高; 采样重演性好; 收获过程不复杂; 放大较容易; 劳动强度小,占用空间小.13 为什么动物细胞培养要用血清培养基？血清培养基使用有何缺点？答：1）因为动物细胞正常生长所需要的一些必要成份均存在于血清中，而且这些成份的组成及其含量至今没有被阐明，因此只能直接采用血清进行培养，而目前寻找无血清的制品代替进行培养并没有获得广泛的成功。2）采用血清培养基有以下缺点： 血清是培养基成本的主要部分；血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代； 血清的存在是产物纯化的主要障碍； 血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加了细胞培养产品潜在的使用危险； 血清同时也有生长抑制的作用； 血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。14 试述聚赖氨酸/海藻酸（PLL/ALG）微囊化的原理：答：原理是：海藻酸的水溶液以钙盐形式存在是呈凝胶状态，用螯合剂去除钙离子后又恢复溶液状态，当海藻酸钙用聚赖氨酸预先处理后，就不再被螯合剂去钙而溶解。据此，先将动物细胞与海藻酸混合，滴入CaCL2溶液中成微珠，用聚赖氨酸处理表面，再用螯合剂处理，则表面还是呈凝胶状态而中间成液态。15 影响聚赖氨酸/海藻酸微囊化的一些因素：答：1）半透膜的孔径大小是关键，由PLL的分子量所决定；2）海藻酸的纯度、黏度及甘露糖醛酸/古罗糖醛酸比例都会影响微囊化的形成及机械性能；3）动物细胞的存活率与微囊化过程的时间及温度pH、渗透压等有关；16 高压匀浆法的作用机理：作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的17 化学渗透法破碎细胞的原理及其优缺点。答：作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷：时间长，效率低；化学试剂有毒；通用性差18 酶溶法机理：就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。优点：一定的选择性；细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程缺点：（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；通用性差， 不易确定最佳条件；19 微波加热法机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：一般只适合对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和树胶等的天然植物20 包含体蛋白溶解的方要方式是什么？在溶解过程中为什么要加入还原剂，为什么要在复性完成后才加入氧化剂？答：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，如8mol/L尿素、68mol/L盐酸胍，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果稍差，异氰盐酸胍最强；去污剂，如SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸，如70%甲酸，可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。21 包含体蛋白质含 有二个以上二硫键应该如何处理？为什么要在复性完成后再加入氧化剂？22 根据流体各组分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程，叫微孔膜过滤。 优点： 容易做到封闭式操作，不受环境污染 设备投资少，操作安全； 加工量可大可小，十分方便； 有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。 缺点： 技术难以掌握，影响因素多； 稳定性和重复性不好； 膜堵塞问题是最难以解决的问题23 双水相萃取的一般原则： 一般的原则是将碎片分配在下层(调节和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配)其好处有： 核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去； 下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些； 蛋白质保持于上相的层有利于其活性的保持； 碎片在下相有利于离心机的连续分离；24 试述包含体复性的基本过程,复性过程错误发生的主要原因是什么?举例分析主要的复性方法的优缺点,为什么LC复性是最好的?包含体复性的基本过程： 分离包含体：第一步是对培养收集的细胞进行破碎，比较有效的方法是高压匀浆结合溶菌酶处理，然后500020000g离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离 洗涤：包涵体沉淀需用去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）洗涤除去脂类和膜蛋白，这一步很重要，否则会导致包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解 溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。去污剂可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。对于含有半胱氨酸的蛋白，在增溶时应加入还原剂打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解，同时还应加入金属螯合剂用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。复性过程错误发生的主要原因是：在去除变性剂的同时，重组蛋白质在体外折叠，分子间存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低，包涵体蛋白折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程之间的竞争。复性方法的优点：透析、稀释和超滤复性法，这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。复性方法的缺点：复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染；稀释法处理量太大，不利于工业放大。LC复性是最好的原因：与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是： 在进样后可很快的除去变性剂； 色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在 脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率； 在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行； 便于回收变性剂，降低废水处理成本。25 包含体蛋白质含 有二个以上二硫键应该如何处理？为什么要在复性完成后再加入氧化剂？26 写 出斯托克斯公式,分析其基本意义.从该公式分析离心的主要条件.斯托克斯公式(Stokes)：Uc=d2(s-L)r2/18。其意义是： 密度差(s-L)越大，离心沉降速度越快； 在密度差(s-L)存在下，固体颗粒尺寸越大，越容易离心； 液体黏度越大，越不容易离心； 离心力（r2 ）的大小对固液分离很有影响，要增大离心力来提高分离效率。离心的主要条件是：转速和时间。27 从达西公式分析利用膜进行固液分离要注意的问题,其目前存在的主要困难是什么?达西公式：V=P/(Rc+Rm) 。从式中可见，在P恒定下，滤饼厚度的增加会降低过滤速度。因此宝座过滤速度不变的一个办法是设法阻