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文档简介

长江师范学院生命科学系,生化与分子生物学实验（二）,实验三基因序列查找及PCR引物设计,陈发波,一、实验目的,1、掌握PCR扩增原理；2、学会在NCBI网站上查找相关生物信息；3、学会利用Primer5软件设计引物,二、聚合酶链式反应（PCR）,聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）:,是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。,PCR基本原理,反应材料,模板DNA,引物对按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计；,DNA聚合酶：耐高温TaqDNApolymerase、PfuDNApolymerase,dNTP,缓冲液溶液Mg2+,Tris缓冲液溶液等,PCR反应步骤,DNA解链（变性）引物与模板DNA相结合（退火）DNA合成（延伸）重复以上三个步骤经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。,反应仪器,PCR仪,变性：94退火：50-60延伸：72循环数：20-30次,PCR仪,最终产物,紫外光观察,2-3小时,凝胶成像系统,混合液,电泳,我不大喜欢动手,我宁肯不动手,我不喜欢做费力的事。作为一个发明家,重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案,KaryB.Mullis(1944-),三、基因序列查询,BCBI（美国国立生物信息中心）主页：/Mapview：/mapview/index.html,四、引物设计,引物设计有3条基本原则：1、引物与模板的序列要紧密互补2、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配),引物设计考虑的主要因素,1、引物长度：一般18-24个碱基对2、相似性较高序列3、引物二聚体或发夹结构4、引物序列的GC含量：一般为40-60%,五、作业,1、在NCBI上查找一段基因序列，将碱基序列抄在实验报告上，标明基
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