分子生物学 第7章 RNA复制与逆转录

.,第7章逆转录与RNA复制,1,.,病毒（virus）是一类个体微小，无完整细胞结构，必须在活细胞内寄生的非细胞型微生物，由蛋白质外壳和单一种类核酸（DNA或RNA）的遗传物质构成。遗传物质是DNA的病毒称DNA病毒（DNAvirus），遗传物质是RNA的病毒称RNA病毒（RNAvirus）。无论是DNA病毒还是RNA病毒，其寄主都是专一性的，以动物为寄主生存的病毒称动物病毒，以植物为寄主生存的病毒称植物病毒。许多病毒感染动、植物后都会引起生物疾病。,7.1动物、植物病毒的遗传物质,2,.,7.1.1病毒遗传物质分类,双链DNA（doublestrandDNA，dsDNA），单链DNA（singlestrandDNA，ssDNA），DNA病毒基因组既可以是线性的，也可以是环形的。多数DNA病毒基因组为双链DNA，子代DNA的合成按半保留复制方式进行。单链DNA病毒的基因组有正链（+ssDNA）和负链（ssDNA）两种形式。+DNA：是mRNA的编码链，DNA：是mRNA的模板链。,7.1.1.1DNA病毒,3,图7-1ssDNA病毒复制及新病毒形成过程,犬细小病毒（Canineparvovirus，CPV）、猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus2，PCV-2）等即属于单负链DNA病毒。,4,.,目前已知的DNA病毒有：乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）不完整的环状dsDNA，外环（DNA）完整而“内环”（+DNA）有缺口；天花病毒（variolavirus，VARV线性dsDNA，末端含有共价闭合的发卡环结构，其由正负链两端单链部分自身配对而成；花椰菜花叶病毒（cauliflowermosaicvirus，CaMV不连续开环双链DNA，进入宿主细胞后可成超螺旋结构；猴病毒40（simianvirus40，SV40）病毒基因组是环状dsDNA。,5,.,7.1.1.2RNA病毒,RNA病毒所含的RNA分子大多为线性。,6,少数单链RNA病毒体内含有多种RNA，如甜菜坏死黄脉病毒（BeetNecroticYellowVeinVirus，BNYVV），基因组包含5种单链RNA。,.,+RNA病毒与mRNA相似，可直接作为翻译的模板用于合成蛋白质。RNA病毒则需要借助RNA复制酶的作用，以自身RNA为模板合成与原病毒互补的+RNA链，再以此+RNA链为模板翻译生成蛋白质。,RNA病毒按基因合成方式又可分为：,RNA复制型病毒,RNA逆转录型病毒,7,.,植物病毒，除少数例外（如花椰菜花叶病毒），几乎都是RNA病毒。其中，单链RNA病毒占RNA病毒的75%，大约有4700种。另外，感染动物的HIV（humanimmunodeficiencyvirus，人类免疫缺陷病毒）、SARS（severeacuterespiratorysyndrome，非典型性肺炎）病毒、甲型H1N1（hemagglutinin1andneuraminidase1）流感病毒、禽流感病毒等均属于RNA病毒。,8,.,7.1.2典型病毒简介,7.1.2.1烟草花叶病毒,图7-2烟草花叶病毒电镜照片,1935年，美国科学家W.M.Stanley首次从烟草病叶榨汁中分离获得，为RNA病毒。,9,.,图7-3HIV的基因组结构,7.1.2.2人类免疫缺陷病毒（HIV）,1983年首次被报道，是一种感染人类免疫系统细胞的逆转录病毒，基因组为两条相同的+RNA，5端由氢键连接，每条RNA长约9.2-9.8kb。,10,.,病毒只有在侵入细胞后才表现出生命现象，复制必须在细胞内进行。但是RNA病毒的复制和转录过程往往完全独立于宿主细胞核，许多RNA病毒在细胞质中复制。只有少数RNA病毒繁殖过程中进入宿主细胞核，如禽流感病毒（avianinfluenzavirus，AIV）。,7.2病毒RNA的复制,11,.,7.2.1RNA复制酶类,由病毒自己编码的RNA复制酶主要是依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）。RNA复制酶功能与特性：以“RNA”为模板合成“+RNA”活性高，而以“+RNA”为模板合成“RNA”活性低；合成RNA链方向为53；能将互补的双链RNA分开；缺少核酸酶活性，校正功能低，差错率高；多数分布在细胞质中，少数在细胞核中；酶活性具有可调控性，复制时，RdRP抑制外壳蛋白表达，而成熟期，外壳蛋白抑制RdRP活性。,12,.,图7-4+RNA病毒的复制,7.2.2+RNA病毒的复制和侵染,小RNA病毒科和披膜病毒科病毒的基因组都是+RNA，例如SARS病毒。,13,.,7.2.3RNA病毒的复制和侵染,这类病毒包括滤泡性口腔炎病毒、流感病毒、副流感病毒、莴苣坏死黄化病毒、麻疹病毒、狂犬病毒等。,图7-5RNA病毒的复制,14,.,图7-6双链RNA病毒的复制,7.2.4双链RNA病毒的复制和侵染,15,.,以RNA分子为模板合成互补DNA（complementaryDNA，cDNA）分子的过程，称为逆转录（reversetranscription）。逆转录的遗传信息流向RNADNA。逆转录病毒，一类特殊的RNA病毒，基因组为两条相同线性+RNA分子（+dsRNA），在靠近5端区域以氢键结合在一起。该+RNA分子无mRNA活性，必须在自身逆转录酶作用下逆转录生成双链cDNA，再与宿主细胞基因组整合，在宿主RNA聚合酶作用下转录出mRNA，才可作为模板进行翻译。逆转录现象是分子生物学研究的重大发现，丰富和发展了中心法则。,7.3逆转录,16,.,7.3.1前病毒假说,1960年，H.Temin提出前病毒假说（provirustheory），认为致病RNA病毒的复制需经过DNA中间体（前病毒），此DNA中间体可部分或全部整合（integration）到寄主细胞DNA中，并随细胞增殖而传递至子代细胞。前病毒假说认为遗传信息可由RNA传递给DNA，这种逆向转录的遗传信息传递方式在当时是不能被生物学界所接受的，因为按照传统“中心法则”，遗传信息只能从DNA传递给RNA，然后再到蛋白质，是一种单向传递的过程。前病毒假说是对传统中心法则的挑战。,17,.,7.3.2逆转录性质与过程,逆转录是RNA水平基因合成DNA的过程。,图7-7逆转录病毒与宿主基因组整合,18,.,7.3.2逆转录性质与过程,逆转录病毒需借助于病毒颗粒的表面蛋白和跨膜蛋白与宿主细胞相融合，病毒颗粒所携带的基因组RNA以及逆转录和整合所需要的引物（tRNA）和酶（逆转录酶和整合酶）得以进入宿主细胞内。在细胞质内进行逆转录，生成的cDNA进入细胞核，在整合酶帮助下病毒cDNA整合到宿主染色体DNA内，成为前病毒（provirus）（图7-7）。前病毒可随宿主染色体DNA一起复制和转录。只有整合的前病毒DNA转录的mRNA才能翻译产生病毒蛋白质。因此，转录和整合所需的酶必须由病毒颗粒自身携带。,逆转录过程：,19,图7-8逆转录病毒RNA的复制过程,逆转录过程可分为十步反应，其中逆转录酶两次转换模板（或称两次跳跃）,20,.,7.3.3逆转录酶,1970年，H.Temin和D.Baltimore分别从致癌RNA病毒劳氏肉瘤病毒（Roussarcomavirus，RSV）和鼠白血病病毒（murineleukemiavirus，MLV）中发现了能以RNA为模板合成双链DNA的酶，即逆转录酶（reversetranscriptase），有力证明了前病毒学说。,21,.,逆转录酶，全称为依赖RNA的DNA聚合酶（RNAdependentDNApolymerase），是一种含Zn2+的多功能酶。,该酶性质如下：RNA指导的DNA聚合酶活性，即以RNA为模板合成互补DNA单链，形成RNA-DNA杂合分子；RNase活性，即水解RNA-DNA杂合分子中的RNA链；DNA指导的DNA聚合酶活性，即以DNA单链为模板，合成另一条DNA单链，形成双链DNA分子；催化合成反应要求有模板、上下游引物、底物（4种dNTP），适当浓度的二价阳离子（Mg2+或Mn2+）；DNA链延长方向按照53规律。,22,.,7.3.4致癌病毒RNA的繁殖过程,致癌病毒属于逆转录病毒，侵入宿主后细胞后并不引起细胞死亡，但可使细胞发生恶性转化，引起人和动物肿瘤，这类病毒包括人类免疫缺陷病毒、白血病病毒、肉瘤病毒等。,23,图7-9致癌病毒RNA的繁殖过程,24,.,7.3.5乙肝病毒DNA的侵染过程,乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，同时也是一种逆转录病毒，由外壳和核心颗粒两部分组成，外壳上的蛋白也就是乙肝表面抗原（HbsAg）。基因组DNA位于核心颗粒内，为双链环状但局部区域是单链或有缺口的DNA，DNA聚合酶依附其上。外环是长链为DNA，长度恒定，“内环”是圆弧的短链+DNA，长度可变，约为长链的5080%。HBV的复制经由DNARNADNA的逆转录过程，即病毒颗粒中的DNA进入细胞之后，由病毒DNA转录出足够长度的+RNA称为前基因组（Pre-genome），然后由RNA中介逆转录合成DNA，前基因组RNA降解，再以DNA为模板合成+DNA。对于这一RNA中介过程，Summer和Mason称其为前基因组假说。,25,.,图7-10乙肝病毒DNA的复制及侵染过程,26,.,逆转录现象的发现与一种RNA病毒劳斯肉瘤病毒（RSV）密不可分，该病毒由美国病理学家劳斯（Rous）首次分离。1910年，劳斯在研究一种鸡肉瘤时发现，用鸡肉瘤组织研磨后的无细胞滤液注射健康小鸡，接受注射小鸡也会发生相同肿瘤，继续使用新形成的肉瘤重复试验得到相同结果，由此说明肿瘤组织滤液确实能导致肿瘤发生。由于已知能够通过滤孔的唯一生命形式就是病毒，因此，劳斯根据该试验认为病毒可以导致癌症的发生。但遗憾的是这个重大发现并没有得到科学界的普遍认可，直到20世纪50年代，劳斯的发现才重新得到科学界的承认，1966年，已经87岁高龄的劳斯获得了该年度的诺贝尔生理学与医学奖。,科学小故事,逆转录的发现,27,.,在此之后，为了阐释RNA病毒致癌理论，特明（H.Temin）继续对RSV进行研究，提出了著名的前病毒假说，指出这类病毒存在着“RNADNA”的特殊途径，在科学界引起了轩然大波。而证实逆转录现象确实存在的直接证据是数年后逆转录酶的发现。1970年H.Temin和D.Baltimore分别从RSV和鼠白血病病毒中提取到了这种RNA依赖的DNA聚合酶。另外，还有杜尔贝科（R.Dulbecco）在肿瘤研究中也支持了H.Temin的“前病毒假说”。他们三人因此于1975年分享了诺贝尔生理与医学奖。,28,.,小结,病毒的遗传物质可以是DNA，也可以是RNA，DNA病毒种类较少，多数病毒都属于RNA病毒。RNA病毒基因组有单双链之分，单链RNA病毒又有正、负链之分，每种RNA病毒的复制及侵染机制不同。,29,.,+RNA既可以直接作为mRNA模板进行翻译，也可以作为模板合成互补的RNA，新合成的RNA则作为模板再合成+RNA而进行复制。RNA病毒侵染细胞后，先以RNA为模板合成互补的+RNA，+RNA既可以作为模板合成RNA而进行复制，也可以被加工成mRNA进行翻译。双链RNA病