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文档简介
-,1,第十章植物种质的超低温保存,-,2,种质保存的概念,种质保存:利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源,使个体中所含有的遗传物质保持其完整性,有高的活力,能通过繁殖将其遗传特性传递下去。,-,3,种质保存的途径,种子保存:种子生活力逐渐下降;易受病虫鼠害侵扰。种植保存:占地多,管理费用高。离体(组织培养)保存:不断继代培养可能导致培养物的染色体和基因型的变异;费用较高超低温冷冻保存:在液氮超低温下保存种质的技术。应用前景广阔。,-,4,一、离体保存方法,使保存种质处于缓慢生长或无生长状态,需要时可迅速恢复生长。抑制生长的方式:降低温度降低环境中的氧含量使用生长延缓剂其它方法,-,5,离体种质保存的优点,占用空间少,节省人力、物力和土地;便于种质资源的交流利用;需要时,可以利用离体培养方法很快大量繁殖;避免自然灾害引起的种质丢失。,-,6,二、超低温冰冻保存技术,-,7,(一)原理,原理:液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了,因而排除了遗传性状变异的可能性,达到长期保存植物种质的目的。在超低温储藏中,植物材料不仅能长期保持形态发育的潜能,还能保持遗传性状的稳定,是迄今唯一不需要继代的、可靠的长期保存方法。,-,8,(二)关键问题及解决措施,关键问题:在超低温条件下,冰冻过程中避免细胞内水分结冰,解冻过程中防止细胞内水分次生结冰。解决措施:选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料;采取预处理措施,提高植物的抗冻力;在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成;,-,9,(三)基本程序,1、材料的选择:组织、细胞特征:细胞分裂旺盛、体积小、原生质浓厚的分生细胞或组织;培养时期:旺盛的对数生长期(抗冻力和存活率高)大小:适宜,-,10,(三)基本程序,2、材料的预处理处理目的:减少细胞内自由水的含量,使细胞经受低温锻炼,以提高组织或细胞的抗冻能力。处理方法:低温锻炼预培养,加入提高材料抗冻能力的物质(如DMSO、蔗糖),-,11,(三)基本程序,冰冻保护剂0预处理如何选择冰冻保护剂:易溶于水;适当浓度下对细胞无毒害;化冻后容易从组织细胞中清除。常用的冰冻保护剂:DMSO、甘油、糖、PEG等。,-,12,(三)基本程序,3、降温冰冻操作1)直接快速冷冻2)分级冰冻法3)玻璃化法,4)干燥冷冻法5)包埋冻存法,-,13,快冻法,0(或其它预处理温度)直接进入液氮。降温速度:每分钟1000以上。适用对象:高度脱水的植物材料,如种子、花粉、球茎、块根等。抗寒性较强或经过低温锻炼的植物,如某些木本植物的枝条或芽。,-,14,分级冷冻法,适用对象:不抗寒的植物或含大液泡和大量水分的成熟材料(包括悬浮培养的细胞等)程序降温仪,起始温度,0.1-10的降温速度,-70-40,液氮,两步冷冻法,转移温度,-,15,分级冰冻法,逐级冰冻法:将经保护剂处理的材料在0预处理后,依次通过不同温度的冰冻,如-10、-15、-23、-40等,一般每级约停留5min,然后学好入液氮。,-,16,玻璃化法,玻璃化:液体转变为非晶体(玻璃态)的固化过程。原理:将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固,形成无规则的玻璃化液,将玻璃化液和材料一起处理一段时间后投入液氮中,此时冰冻保护液和材料一起进入玻璃化状态(冰冻过程中水分子没有发生重排,不形成冰晶,也不产生结构和体积的改变。,-,17,玻璃化法,优势:设备简单、操作方便、冻存效果好。影响因素:玻璃化冰冻保护液的组成及浓度;植物材料的脱水温度和脱水时间。,-,18,4、化冻操作快速化冻:
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