低分子肝素研究进展.docx

低分子肝素研究进展李颖颖 1，李京，王悦，范慧红 2（中国食品药品检定研究院，北京 100050）摘要低分子肝素是继肝素发展而来的新型抗凝血药。本文就低分子肝素的研究背景、结构与生物活性、制备技术、制剂研发动态等方面作一综述，并针对国内外低分子肝素的研究动 态对今后低分子肝素的发展前景进行展望。关键词低分子肝素；进展The research progress of Low molecular weight heparinLi Ying-ying,Li Jing,Wang Yue,Fan Hui-hong( National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)AbstractLow molecular weight heparin is the new type of anticoagulants developed byheparin.Thepapersummarizedtheresearchbackgound,structureandbiologicalactivity,preparation technology,research development of preparation of low molecular weight heparin, and so on. The paper also outlooked the development prospect of low molecular weight heparin in connection with the research dynamics of low molecular weight heparin both at home and abroad.Key wordsLow molecular weight heparin;progress背景介绍肝素是一种酸性黏多糖，由 Mclean1首先发现其抗凝作用，Brinkous 等2证明了其抗 凝血活性，自 20 世纪 30 年代开始用于临床，经过 70 多年的临床研究，人们已对肝素的抗 凝作用机理有了深刻的认识。随着对肝素的深入研究，特别是对以往认为无活性的低分子 组分对a 因子和a 因子（凝血酶）的作用差异的认识，为开发低分子肝素提供了理论依 据，20 世纪 70 年代末，低分子肝素进入临床。3低分子肝素（Low molecular weight heparin,LMWH）是由普通肝素经物理、化学或酶 解聚方法而得，分子量范围为 30008000，具有较肝素更优的抗血栓活性，且与肝素相比， 出血副作用少、生物利用度高、半衰期长、抗凝效果可以预测且无需实验室监测，目前临 床适应症不断扩大。历经几十年的发展，LMWH 的研究已取得较大的进展。本文将就 LMWH 的 结构与生物活性、生产制备技术、制剂的研发及质量标准作一综述。1.LMWH 的结构与生物活性1.1 结构LMWH 的基本结构是由二糖重复单元（糖醛酸 GluA 和葡糖胺 GlcN）通过 1,4-糖苷键连 接构成的线性硫酸化多糖。二糖单元中的糖醛酸构成有葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸两种，连 接二糖单元的 1,4-糖苷键有、两种构型，GlcN 上的羟基可以硫酸化、乙酰化或以未保 护的氨基形式存在。4此外，糖醛酸的组成和每个二糖单元的平均硫酸化取代度不同，又由 于 LMWH 末端结构的差异性，分子量的多分散性，硫酸根、羧酸根带来的高负电荷性等使 LMWH作者简介 1 第一作者：李颖颖，女，硕士研究生，药物分析专业，电子邮箱：; 2 通讯作者：范慧红，女，博士，研究员，生化药品质量分析，电子邮箱：.成为众多黏多糖中结构极其复杂的一种。对于 LMWH 的结构阐释，Choay 等5提出了一种高亲和肝素的模型，同时分别列举了 3 种高亲和 LMWH 的糖单元数、分子量、作用机理及活性。 分子量、硫酸化程度及其他因素与其生物活性的紧密联系，并指出为彻底了解 LMWH 的生物 6该结构的阐释也是基于对 LMWH 生物学活性的深入研究。石峰等7探讨了 LMWH 的化学结构、 活性必须了解其精确结构。至今为止，LMWH 的精确化学结构仍热是研究的重点与难点。1.2生物活性及应用进展LMWH结构的多样性赋予了其独特的生物活性多样性。LMWH在临床上主要表现为抗栓活性和抗凝活性的应用。抗栓活性依赖于特殊的戊糖活性中心，抗凝活性则不仅依赖于戊糖活性中心，还与分子量有关，至少需要18个糖单元长度才能使LMWH、AT和a形成三元复 合物发挥抗凝效果。此外，LMWH的抗炎、抗肿瘤、抗病毒及其他新的生物学功能不断被发 现。除抗凝抗栓作用外的其他生物活性研究也是国内外学者进一步开发LMWH的前景方向。 如Haining Tan等8发现用聚乙二醇和LMWH修饰的ES（内皮他丁）其抗内源性血管生成活性 及抗肿瘤活性增加。这是将LMWH用作修饰剂的研究。Satoko Kishimoto等9曾经将LMWH与鱼 精蛋白混合（v:v=7:3）制备出可注射微粒。该微粒可作为肝素结合生长因子（GFs）及不 同粘附细胞的载体，还可作为有效的细胞培养涂层基体。可见LMWH的应用逐渐拓展，尚待 发现。相比普通肝素，LMWH的临床应用更为广泛且副作用较少，但是其抗凝活性低，且由 于分子量小，不能被鱼精蛋白完全中和，同样增加了临床应用时的风险。基于此现象，开 发新型LMWH成为必然之势。1.3 新型 LMWH 的研制理念及研究进展1.3.1 结构修饰的 LMWH已证实LMWH发挥抗凝作用的特异戊糖结构中的3-O硫酸基等硫酸化基团是必需的，戊糖 序列的硫酸化程度高有助于抗凝活性的发挥。针对此问题，对LMWH的结构进行改造，提高 戊糖序列硫酸化程度成为其中一个开发新型LMWH的设计理念。尹晓娟等4较详细地列举了肝 素类寡糖的合成方法。文中提到了几种硫酸化修饰方法，为LMWH的硫酸化修饰提供了参考： 其一是利用N-去乙酰化酶/N-磺酸基转移酶（NDST）将GlcNAc单元上的N-乙酰基脱除并对裸 露出来的氨基进行硫酸化修饰；其二是利用2-位O-磺酸基转移酶（2-OST）对IdoA 的C2-位 羟基进行硫酸化；其三利用3-位和6-位O-磺酸基转移酶（3-OST 和6-OST）催化葡萄糖胺单 元的C3-位和C6-位羟基引入磺酸基等方法。齐文静等10通过3-O-硫酸基转移酶提高了戊糖 活性中心数量，从而使酶修饰反应后的LMWH抗凝活性增加了3-5倍。1.3.2 其他新型 LMWH与 AT结合的特异戊糖序列含量可以表征抗凝活性大小，但无法被直接监测，以此为 突破口，研究者用肝素酶、控制肝素解聚，发现含有 3-O-S 的特异四糖序列（该 四糖序列是由功能编码命名法中的4-7 双糖组成）不会被肝素酶降解，基于上述理论，通 过监测控制4-7 双糖组分的含量（4-7 组分的含量与抗 Fa 和 Fa 活性成正比）、 肝素分子量长度等研制出具肝素的高抗凝活性、可被鱼精蛋白中和等优势的新型 LMWH。 11Sundaram 等12首次进行了肝素类药物的合理设计研究，研制出了两种新型 LMWH。新型 LMWH 可以集合肝素和 LMWH 的优点，保持肝素的高抗凝活性，抗 Fa/Fa 活性比值优于普 通肝素且被鱼精蛋白中和的程度优于 LMWH，减少了出血风险。1.4 超低分子量肝素（ULMWH）的研制理念及研究进展超低分子量肝素（ULMWH）是在 LMWH 的基础上开发的又一个新品种的抗血栓药物，分 子量 20003000。与 LMWH 相比，其抗血栓作用强，皮下注射易吸收，无毒副作用。ULMWH 具有较 LMWH 更高的抗 Fa/Fa 活性比值，因此抗栓应用比当前的 LMWH 有一定的优势。 国外研究者很早已开始研制，国内起步较晚：如早期法国的 CY222，其平均分子量为 2500； 意大利的 OP2000，其平均分子量为 2000。13近几年赛诺菲-安万特公司的 AVE5026 及 ROVI 公司的 RI-14 等。11ULMWH 除具有一般 LMWH 的作用外，更重要的是抗血栓作用更突出，且几乎没有出血的风险，几乎不需要监测即足以达到安全治疗的目的。13此外，于天贵等14研究发现 ULMWH 对谷氨酸和叠氮钠诱发的大鼠皮质神经元化学损伤有一定的保护作用，这 是对抗栓抗凝作用以外的活性研究。可见，ULMWH 的研究是肝素类抗凝药物一个较有前景的 方向。2.制备技术研究进展2.1 固定化酶技术的应用LMWH 的制备方法大体分为物理分级法、化学裂解法和酶解法，目前多采用的是化学裂 解法或酶解法。化学裂解法生产工艺简单、成本低廉、产品质量易于控制，常用于工业生 产。与化学裂解法比，酶解法具有反应条件温和，不改变肝素结构，便于检测，硫酸化程 度较高等优点，此外由于酶解法的酶切位点清晰，能够特异性地断裂肝素链上的糖苷键， 因此可用于 LMWH 的结构测定；但同时酶解法成本较高，且酶稳定性差，对其纯化过程会造 成酶活性的损失，产率降低。因而有必要改善和优化酶降解技术。固定化酶技术是将提纯的肝素酶固定于载体上的技术。即用固体材料将酶束缚或限制 于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收和重复使用的一类技术。该技术用 于肝素酶的固定化，可以克服肝素酶稳定性差，易失活，不能重复利用的缺陷，产品和肝 素酶易于分离，酶可反复利用，极大的节约了成本。6因此，固定化酶技术备受关注。目前 该技术的研究热点在于载体的开发与利用以及开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提 高转化率和生产能力。2.2 肝素酶的高效生产技术目前酶解法制备LMWH采用的酶为肝素酶，它最初从肝素黄杆菌发现和分离，后来发现 也存在于其他微生物及动物组织中，但商品化的肝素酶均来自于肝素黄杆菌。因此，肝素 酶的高效生产技术研究是备受关注的研究课题。为达到肝素酶的高效生产，研究者寻找其 他肝素酶的来源或促进肝素黄杆菌产肝素酶。高宁国15等从土壤中筛选到一株肝素酶的产 生菌棒杆菌 (Corynebacyerium)。陈银等16结合微生物基因组测序的进展对肝素酶的潜 在来源进行了讨论。马小来等17探讨了CaCO3能促进肝素黄杆菌产肝素酶的机理。2.3 光化学制备法的应用化学裂解法和酶解法是工业化生产LMWH的主要方法，但是这两种方法或反应条件剧烈， 或引入刺激性化学物质，导致多糖骨架中单糖单元的分解等，这些副反应会降低产品产量 与质量。因此，Kyohei Higashi等18采用一种新方法光化学制备法制备新型LMWH，反 应中加入了催化剂TiO2，光化学反应后可以通过离心或过滤去除，因此可制得高纯产品。 得到的新型LMWH与市场上大部分LMWH（依诺肝素钠、达肝素钠等）抗凝活性相当，且通过 光化学制备法制得的LMWH同时含偶数和奇数个单糖单元的寡糖片段。3.LMWH的制剂研发目前LMWH只有注射剂应用于临床，注射剂疗效确切、易吸收，但半衰期短，需反复注 射，且患者可能有不良反应，不宜长期用药。因此，临床上迫切需要LMWH的非注射制剂等 新剂型来填补应用缺陷。利用吸收促进剂改善LMWH的口服吸收是研究最多的领域之一，此 外，国内外研究者还将LMWH制成微囊、微球、脂质体等口服制剂，还有微乳制剂、聚乙二 醇微粒、多聚纳米粒等其他剂型。19口服制剂是研究最多且前景较好的一种新剂型。希美 加群是第一个口服LMWH制剂，于2004年在德国首次上市，但随着其毒副作用的出现，于2006 年撤市。有关专家一直在寻找一种理想的LMWH口服制剂，同时采用各种方式以将口服制剂 推广至临床。如研究者采用各种材料和技术将LMWH包裹起来，使其免遭胃液的破坏；同时 为了增加其吸收，又通过减小微粒粒径，增加药物的脂溶性，中和其强负电荷和增加细胞 膜的通透性等方法，将其制成胶囊、脂质体、微乳等制剂。结合最新进展的基因组学/蛋白 质组学和纳米技术，有望将LMWH口服制剂逐渐完善。204.LMWH的质量标准概况目前我国国家药典还未收载LMWH，2005年局颁标准仅能满足BP或EP总则的要求，基本上只要求产品满足LMWH的两个最基本特征；进口注册标准和新药试行标准与BP（2012）仍有差距，杂质检测不是很严格，检测方法不够灵敏。 21随着对LMWH结构研究的不断深入， 不断增补对LMWH末端结构的描述，USP32版的依诺肝素钠就收载了1,6-脱水结构的要求。3EP 目前也有关于1,6-脱水结构的草案，但我国还没有，可见我国LMWH的质量标准研究需要在 结构确证、杂质检测、产品分类管理等方面进一步深入。国内外质量标准仍存一定差距， 因此其质量标准亟待完善。目前中检院正在承担国家药典委员会的LMWH标准提高任务，为 LMWH收录到2015年版国家药典积累数据。5.展望LMWH自19世纪70年代进入临床以来，发展迅猛，已经占据抗凝药物市场的大部分份额， 尤其在心脑血管疾病的应用中发挥巨大的作用。肝素是其最主要的制备来源，而肝素主要 是从猪或牛等哺乳动物的器官和组织中提取而来，保证肝素质量至关重要。由于生物来源 的原材料的局限性，有关学者已采用生物体内或人工合成肝素的方法，人工合成肝素分化 学法、酶法及化学酶法合成等。由于天然多糖结构的复杂性，化学法合成较复杂且合成率 低。随着基因工程方法克隆表达相应的酶以提高酶产量等生物工程方法的发展，酶法合成 肝素及肝素类似物成为一种较好的来源途径。22所以肝素的来源也是值得探究的领域。日 本有人23发现一种来源于海参中的糖胺聚糖的解聚产物（DHG），不仅表现出与肝素类似的 抗凝血活性，且剂量在一定范围内时，动物实验引起的出血副作用低于LMWH和普通肝素； 巴西和美国研究员从虾中分离得到一种LMWH24，该来源的LMWH的抗凝血活性大于哺乳类动 物来源的LMWH。这些研究也启发我们从哺乳动物来源外的其他来源中获取LMWH。因此，关 于LMWH的研究，进一步确定其精细结构、寻找新来源及研制新剂型应用于临床等方面均是 研究的热点和难点，需要各国、各界学者的不懈努力共同为LMWH的进一步开发利用贡献力 量。参考文献1L.Cardilo-Reis，M.C.M. 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