细胞毒实验ppt课件

细胞毒实验,1,可健吉70090310季敏70090312李壮70090313,细胞毒实验的分类、原理性检测方法与应用,2011年11月,细胞毒实验,2,细胞毒实验,3,细胞毒检测技术主要根据原理不同进行区分,细胞毒实验,4,肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定,淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定,细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定,抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC),2011年11月,细胞毒实验,5,补体依赖的细胞毒实验,2011年11月,细胞毒实验,6,2011年11月,细胞毒实验,7,2011年11月,细胞毒实验,8,2011年11月,细胞毒实验,9,2011年11月,细胞毒实验,10,血红蛋白酶释放法（HbE-Assay）同位素释放法：51Cr、125I-UdR、3H-TdR等乳酸脱氢酶释放法MTT比色法测定法,细胞毒实验,11,同位素释放法,乳酸脱氢酶释放法,MTT比色法,细胞毒实验,12,原理,NK（naturalkiller）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。,细胞毒实验,13,NK细胞分离方法,密度梯度离心Ficoll密度梯度离心Percoll密度梯度离心磁化细胞分离器分离法,细胞毒实验,14,同位素释放法,细胞毒实验,15,同位素释放法,G0,G1,S,NewDNAOrProtein,cpm,Na251CrO4、3H-TdR、125I-UdR,细胞毒实验,16,应用放射性同位素（如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数（cpm)，即可计算出NK细胞活性。,同位素释放法,细胞毒实验,17,Cr标记靶细胞,未死亡靶细胞,NK细胞,利用测Cr的放射脉冲得效应细胞活性,死亡靶细胞Cr释放,攻击,同位素释放法,细胞毒实验,18,本法结果准确、重复性好，但存在以下不足：使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验。细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。,同位素释放法,细胞毒实验,19,本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定，其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假阳性结果。,MTT（或MTS）还原法,细胞毒实验,20,乳酸脱氢酶释放法-原理,乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的值，可测得杀伤细胞毒活性。,细胞毒实验,21,乳酸脱氢酶释放法,靶细胞YAC-1,NK杀伤,靶细胞膜损伤,LDH释放到细胞外,LDH底物,无色底物,还原,有色物质,测OD570值,杀伤率(%)=,实验值-自发释放值,Max-S自发,100,最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值,细胞毒实验,22,无菌取脾研磨成单细胞悬液+2ml1640（无FBS),细胞计数【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝,30l/孔1mol/L柠檬酸,酶标仪测吸光度值：OD570nm,结果判定：,加板(三复孔)(加法见附图),5%CO237培养2小时,离心，取100ul上清移入新孔，37孵育10min,加入底物100ul/well室温避光孵育15min,培养YAC1细胞10%FBS1640培养液,调细胞浓度1106/ml,调细胞浓度1107/ml,操作流程,细胞毒实验,23,单细胞悬液的制备小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml1640培养液的平皿内。用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml离心管中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml1640培养液重悬细胞。细胞计数：取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。调脾细胞浓度至1107/ml，每组所需总量为1ml调YAC1细胞浓度至1106/ml，每组需2ml注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。,实验步骤,细胞毒实验,24,细胞培养：按图所示加板。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于375%CO2培养箱中，培养2小时。LDH底物：在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。室温避光保存15min。取出，加入1mol/L柠檬酸，30l/孔。酶标仪读数前保证没有气泡。结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。结果判定：Max（靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值S自发（靶细胞自发释放）=自发释放孔均值-培养基对照孔均值注：S自发0，做“0”处理,细胞毒实验,25,Max=E-FS自发=A-G,加板方法,细胞毒实验,26,算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标为E:T,纵坐标为SI值。把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用Excel作的图一起贴到实验记录本上。要对结果进行分析，写出影响结果的因素，及注意事项。,结果处理,细胞毒实验,27,Excel作图,细胞毒实验,28,检测方法,细胞毒实验,29,1.1.1alamarBlue一步荧光测定法alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3105/孔即可）。含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果,细胞毒实验,30,1.1.2Calcein-AM荧光扫描测定法Calceinacetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂（一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便可靠，无南收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。不足的是对某些高核浆比的细胞染色效果不太好；Calce-in-AM在高浓度时可能损害细胞功能。,细胞毒实验,31,1.2.1PE-mAb/FITC-annexinV荧光标记法正常细胞的磷酯酰丝氨（PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早期事件，先于膜通透性增加所致51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8-PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用FITC-annexinV标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。本法简单快捷，无需预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；与51Cr法相关性好（r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力学分析；可允许效应细胞与靶细胞长时间共育，对探讨E通过合成及分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；可用荧光显微镜观察测定。,细胞毒实验,32,不能被PE-mAb标记的为靶细胞,未死亡靶细胞,FITC-annexinV标记凋亡靶细胞,PE-mAb标记效应细胞,用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。,细胞毒实验,33,1.2.2DIOC18/碘化丙锭（PI）荧光标记法用DIOC18标记靶细胞膜，用红色荧光核染料PI标记效应细胞和死亡靶细胞，通过流式细胞分析可清楚区分2类细胞。在用人和猪的外周血单核细胞（PBMC）作效应细胞时可观察到靶细胞溶解%与不同效应细胞：靶细胞比之间存在良好相关。本法简单易行，与51Cr释放法同样敏感可信，重复性和相关性很好，另一优点是可用新制备的脾细胞作靶细胞，不再需要培养及活化靶细胞，还可测多种动物的NK活性。,细胞毒实验,34,DIOC18标记靶细胞膜,未死亡靶细胞,PI标记死亡靶细胞b,PI标记效应细胞a,pI标记m=a+b.b=m-aDIOC18标记靶细胞用流式细胞仪区分并定量此2类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。,细胞毒实验,35,1.2.3PKH-26/CFSE荧光标记法Sheehy等采用PKH26和CFSE双示法可有效地标记和区分靶细胞，其标记靶细胞后的自发释放仅为51Cr释放法的1/40，因此可更准确地评价及检测少量CTL介导的细胞溶解。平行试验结是显示本法与51Cr释放法明显相关（r2=0.998，p0.0001），对进一步研究效应细胞溶解细胞的机理具有应用价值。,细胞毒实验,36,PKH26和CFSE双示法靶细胞,未死亡靶细胞,死亡靶细胞自发释放,自发释放仅为51Cr释放法的1/40，因此可更准确地评价及检测少量CTL介导的细胞溶解,细胞毒实验,37,Ritchie等发现抗原标记的树突状细胞DC(dendriticcell)在体内的存活与CTL活性明显相关。他们先将DC用两种不同荧光物质标记，再分为两部分，一部分用抗原标记，另一部分不标记，二者混合后注入小鼠皮下，发现只有标记了特异抗原的DC自引流淋巴结清除，未标记抗原的DC仍存于局部不受影响，改变注射部位及其他参数不影响本法测定结果。据此他们建立了这一简单灵敏体内测定CTL活性的方法。由于DC可有效摄取及呈递复合抗原、核酸及凋亡小体，本法除可测定用特异性肽负荷的DC免疫或用流感病毒感染所产生的CTL反应外，也可用于评价不具有肽表位特征的抗原的CTL活性。,细胞毒实验,38,报告基因转染法,应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如-半孔糖苷酶或荧光素酶基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CTL、NK细胞及药物介导的细胞毒和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性（代表靶细胞死亡数目），可以计算效应细胞杀伤靶细胞%。其中gal半衰期较luc长，应用较为方便。本法灵敏度高，自发释放背景低；用不同告基因转染的细胞系可同时测定杀伤活性，结果互不干扰，还可通过转基因小鼠进行在CTL活性研究；用不同的基因调控元件（如组织特异性的或活性可诱导的启动子）控制报告基因的表达，可进一步深入进行机理研究。其主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力rb告基因在有些靶细胞难以转染或表达。,细胞毒实验,39,应用基因转染技术将报告酶转染靶细胞,未死亡靶细胞,释放入培养液中报告酶活性代表靶细胞死亡数目,通过测定释放入培养液中报告酶活性,可以计算效应细胞杀伤靶细胞%,细胞毒实验,40,4.1“鸡尾酒“混合刺激法Swincarski等介绍了一种测抗原特异性CTL活性方法，将外周血细胞在体外用一种含有抗原、细胞因子、共刺激分子及放射照射的饲养细胞的混合“鸡尾酒”刺激7天后，在有限稀释条件下可从微孔板快速测得抗原特异性信号。本法灵敏性高，较传统的CTL测定方法更有效，尤其是本法仅需150l小鼠外周血而无需处死动物，因此可增加每次测定时的小鼠数量，还可在体内研究过程中于不同时间从每个小鼠多次取血测定，大大方便了CTL反应及其体内效果的相关性研究。,细胞毒实验,41,4.2ELISPOT试验酶联免疫斑点试验（ELISPOT）通过检测抗原诱导的细胞因子（如IFN-）的分泌，可在体外定量测定病人PBMC中抗原特异性T细胞反应(T细胞受抗原刺激产生并释放IFN-)。本法在肽特异性分泌IFN-的T细胞数量与细胞毒活性之间，与标准的51Cr释放法相关良好，是一种在临床试验中监测病人对肿瘤抗原的CTL或Th-细胞反应的灵敏、准确、价廉、的方法，可对肿瘤病人的抗肿瘤疫苗疗法的优化提供必要的信息。,细胞毒实验,42,以上几种CTL测定方法各有特点，其中随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法，而微量和直接测定体内CTL活性的方法将为细胞免疫研究开辟新路。,细胞毒实验,43,目前，已能够从多种人类实体瘤（原发性、转移性肿瘤）及恶性腹水中分离出TIL；在IL-2存在下，TIL能够有效增殖达1000倍以上，其经冻存复苏后，仍然保持较好的增殖和杀瘤活性，这为临床长期应用TIL提供了可能性。但TIL的研究尚处于早期阶段，还有许多问题需要解决。此外，人体是由细胞组成的，其中免疫细胞(T细胞、B细胞、NK细胞以及LAK等)起着必不可少的重要作用，它们可制约突变细胞以及病原体对机体的侵害，使人体保持健