基因工程—获取目的基因

,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库(Genomiclibrary),是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库,2)cDNA文库(cDNAlibrary),基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库（部分）,基因文库的目的,为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,基因文库的分类,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,从基因文库中得到目的基因的方法,2、利用PCR技术扩增目的基因,生物体内DNA分子复制的条件,DNA聚合酶的特性,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。,小资料：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。,5，端含磷酸基团,3，端含羟基,3，端,5，端,3,5,5,DNA的复制方向,DNA分子的热变性原理,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,变性的目的：,复性的目的：,解开双链,有利于引物与两条单链结合,在80100的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性,PCR原理,高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。,PCR反应的条件,DNA模板；分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶；控制温度，但不需解旋酶；需要在一定的缓冲液中进行。,1、PCR的反应步骤,PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个步骤变性、复性和延伸。,循环之前的一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。,PCR的反应过程,950C变性,550C复性,720C延伸,第一轮,DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸