第六章免疫标记技术ppt课件

第六章免疫标记技术,1,第六章免疫标记技术,第六章免疫标记技术,2,第六章免疫标记技术,第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节免疫酶技术,第六章免疫标记技术,3,放射免疫技术（radioimmunoassay，RIA）,第一节放射免疫技术,第六章免疫标记技术,4,RosalynYalow（美国）,（1977年获诺贝尔生理和医学奖）,“forthedevelopmentofradioimmunoassaysofpeptidehormones”,VeteransAdministrationHospitalBronx,NY,USAb.1921,1959年，Yalow和Berson首次应用放射免疫分析法测定胰岛素,第六章免疫标记技术,5,与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。,第六章免疫标记技术,6,放射免疫技术,优点：特异性强，即抗原抗体的特异性反应；灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；操作流程简单易行，加样程序简单，测量和数据处理自动化；样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤；应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。缺点：需要昂贵的检测仪器；同位素污染。,第六章免疫标记技术,7,放射免疫技术的原理,是建立在标记抗原（或配体）和待测抗原（或配体）对有限量的特异性抗体（或受体）的竞争性抑制反应基础上的，最终形成的放射性标记复合物与被测配体（或抗原）呈负相关，因而亦称竞争性放射免疫技术。,第六章免疫标记技术,8,RIA测定原理,Ag*+AbAg*-Ab（F）（B）+AgAg-Ab,RIA测定原理的定量示意图,Ag*AgAbAgAb游离AgB/FB/T,6/26/8,3/53/8,2/62/8,4/44/8,第六章免疫标记技术,10,返回,第六章免疫标记技术,11,一、免疫荧光技术的原理二、建立免疫荧光技术的必备条件三、免疫荧光技术的基本方法,第二节免疫荧光技术,返回,第六章免疫标记技术,12,一、免疫荧光技术的原理,免疫荧光技术（immuno-fluorescencetechnique）二十世纪40年代，Coons等首先用荧光素作为示踪物质标记抗体，检测可溶性肺炎双球菌多糖抗原，从而创建了免疫荧光示踪技术。,第六章免疫标记技术,13,原理：将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。,第六章免疫标记技术,14,第六章免疫标记技术,15,激发光和发射光,第六章免疫标记技术,16,三结合：抗原抗体反应的高度特异性荧光的敏感可测性显微技术的高度精确性可以准确、特异、灵敏、快速地检测和定位微量物质。,第六章免疫标记技术,17,主要优点：特异性强，速度快，敏感性高，能准确检测少量抗原或抗体在组织细胞内的定位分布。主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定的客观性不足。,返回,第六章免疫标记技术,18,二、建立免疫荧光技术的必备条件,1荧光素2荧光素与蛋白质结合物的制备3荧光检测仪,返回,第六章免疫标记技术,19,1荧光素,荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质。,第六章免疫标记技术,20,荧光的种类自发荧光二次荧光,第六章免疫标记技术,21,常用的荧光素,返回,第六章免疫标记技术,22,3荧光检测仪,（1）荧光显微镜（2）荧光分光光度计（3）流式细胞仪（4）荧光偏振光分析仪,第六章免疫标记技术,23,荧光显微镜,第六章免疫标记技术,24,荧光显微镜的构造,第六章免疫标记技术,25,第六章免疫标记技术,26,第六章免疫标记技术,27,第六章免疫标记技术,28,返回,第六章免疫标记技术,29,三、免疫荧光技术的基本方法,（1）直接荧光染色法（2）间接荧光染色法（3）补体荧光染色法（4）特殊染色法,返回,第六章免疫标记技术,30,（1）直接荧光染色法,将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。优点：简单、快速、特异性高。缺点：敏感性差。,第六章免疫标记技术,31,第六章免疫标记技术,32,第六章免疫标记技术,33,返回,第六章免疫标记技术,34,（2）间接荧光染色法,将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。,第六章免疫标记技术,35,第六章免疫标记技术,36,第六章免疫标记技术,37,（2）间接荧光染色法,优点：可检测多种不同的抗原抗体复合物，具一定通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多。,第六章免疫标记技术,38,第六章免疫标记技术,39,第六章免疫标记技术,40,返回,第六章免疫标记技术,41,（3）补体荧光染色法,将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。,第六章免疫标记技术,42,第六章免疫标记技术,43,（3）补体荧光染色法,优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。,第六章免疫标记技术,44,返回,FLASH,第六章免疫标记技术,45,（4）特殊染色法,双标记免疫荧光技术双色免疫荧光技术反衬染色法,返回,第六章免疫标记技术,46,双标记免疫荧光技术,在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行免疫荧光染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同类型的抗原。,第六章免疫标记技术,47,双标记免疫荧光技术,如：FITC（黄绿色荧光）和RB200或TRITC9（桔红色荧光）,返回,第六章免疫标记技术,48,双色免疫荧光技术,如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（碘化丙锭）。,第六章免疫标记技术,49,双重染色标本的单色和双色观察,WU,WIB,DUALBAND,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,第六章免疫标记技术,50,多重染色标本的多色观察,FITC+TexasRed+DAPI,返回,第六章免疫标记技术,51,反衬染色法,是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。,第六章免疫标记技术,52,反衬染色法,如：用RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体。,返回,第六章免疫标记技术,53,第三节免疫酶技术,1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs两组学者分别用酶代替放射性同位素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术（enzymeimmunoassay，EIA）。,第六章免疫标记技术,54,一、原理二、建立免疫酶技术的条件三、免疫酶技术的基本方法四、通用与放大技术,第三节免疫酶技术,返回,第六章免疫标记技术,55,一、原理,免疫酶技术（enzymeimmunoassaytechnique）：就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。,第六章免疫标记技术,56,酶催化反应的两种基本形式：（1）E+S（ES）E+P（2）E+S（ES）+D1E+P+D2E：酶S：酶作用的底物P：底物分解后的产物（有色化合物）D1：供氢体D2：为D1的氧化型（有色化合物）,第六章免疫标记技术,57,优点：灵敏度高，特异性强；可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查；试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染；,第六章免疫标记技术,58,结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展；操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。,第六章免疫标记技术,59,缺点：标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。,返回,第六章免疫标记技术,60,二、建立免疫酶技术的条件,1标记酶2免疫酶结合物的制备3酶标检测仪,返回,第六章免疫标记技术,61,常用的标记酶,辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP）葡萄糖氧化酶（glucooxidase，Glu）-D-半乳糖苷（-D-galactosidase，-D-Gal）,第六章免疫标记技术,62,返回,第六章免疫标记技术,63,返回,第六章免疫标记技术,64,三、免疫酶技术的基本方法,酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbent，ELISA）,第六章免疫标记技术,65,（1）直接标记法（2）间接标记法（3）夹心法（4）竞争法（5）抗体桥联法（6）抗酶抗体法（7）ELISPOT,返回,第六章免疫标记技术,66,(1)直接标记法(directlabeling),第六章免疫标记技术,67,directELISAforAg,第六章免疫标记技术,68,directELISAforAb,返回,第六章免疫标记技术,69,（2）间接标记法（indirectlabeling）,第六章免疫标记技术,70,返回,第六章免疫标记技术,71,（3）夹心法（sandwichassay）,第六章免疫标记技术,72,（3）夹心法,第六章免疫标记技术,73,双夹心法,返回,第六章免疫标记技术,74,（4）竞争法,a固相抗体竞争法b固相抗原竞争法,第六章免疫标记技术,75,a固相抗体竞争法,第六章免疫标记技术,76,b固相抗原竞争法,返回,第六章免疫标记技术,77,（5）抗体桥联法（immunobridge）,第六章免疫标记技术,78,返回,第六章免疫标记技术,79,（6）抗酶抗体法（peroxidase-antiperoxidase，PAP）,第六章免疫标记技术,80,第六章免疫标记技术,81,PO抗PO法,返回,第六章免疫标记技术,82,第六章免疫标记技术,83,返回,第六章免疫标记技术,84,四、通用与放大技术,1SPA通用系统2ABC放大系统,返回,第六章免疫标记技术,85,SPA通用系统,（1）SPA的发现（2）颗粒SPA的应用（3）SPA的标记和应用,返回,第六章免疫标记技术,86,（1）SPA的发现,1940年Verwey发现金黄色葡萄球菌的某些菌株，可与人正常血清在双相免疫扩散试验中出现沉淀线。1958年Jensen用离子交换树脂分析证明，该成分是一种细菌胞壁上不含糖的蛋白质，命名为金黄色葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalProteinA，SPA),第六章免疫标记技术,87,Forsgren等证明SPA与IgG分子的Fc段结合，为假免疫反应。生产SPA的国际标准菌株:Cowan株（NcTc8530和ATCC12598）不生产SPA的标准株:Wood46,返回,第六章免疫标记技术,88,（2）颗粒SPA的应用,协同凝集试验SPA吸收IgG试验应用IgG-SPA制备抗IgG的抗体,返回,第六章免疫标记技术,89,（3）SPA的标记和应用,荧光素标记SPA及应用酶标记SPA及应用,第六章免疫标记技术,90,酶标SPA法,返回,第六章免疫标记技术,91,2ABC放大系统,生物素-亲合素系统（biotin-avidinsystem）的特点：高度特异性高度灵敏性简单快速安全稳定,第六章免疫标记技术,92,（1）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性（2）生物素的标记技术（3）亲合素的标记技术（4）生物素-亲合素系统的应用,返回,第六章免疫标记技术,93,（1）生物素、亲合素、链霉亲合素的特性,生物素（biotin，B）又称维生素H、辅酶R（羧基转化酶的辅酶）MW244.31，pI3.5分子式为C10H16O3N2S,第六章免疫标记技术,94,Biotin,第六章免疫标记技术,95,亲合素（avidin，A）：又称卵白蛋白、抗生物素。MW68,000，pI1010.5，为碱性蛋白，含糖量高达10%；1个亲合素可与4个生物素结合；Ka=1015mol/L,第六章免疫标记技术,96,链霉亲合素（streptavidin，SA）：是Streptomycesavidin菌分泌的一种蛋白质