江苏地方标准 DB 32 3771-2020渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定液相色谱-串联质谱法

ICS65.150B 51DB32江苏地方标准DB32/T 37712020渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定液相色谱-串联质谱法Determination of quinolones in aquaculture water by LC-MS/MS2020 - 04 - 08发布2020 - 05 - 15实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T 37712020 前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业农村厅提出。本标准由江苏省渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：江苏省淡水水产研究所、江苏省水产质量检测中心。本标准主要起草人：孟勇、沈美芳、朱晓华、杨洪生、王静、张美琴、谭秀慧、刘崇万、王凯、朱凛。7渔业养殖用水中喹诺酮类抗生素测定 液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了渔业养殖用水中16种喹诺酮类抗生素残留量的前处理和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于渔业养殖用水中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、丹诺沙星、双氟沙星、奥比沙星、司帕沙星、氟罗沙星16种抗生素残留量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 原理水样用混合纤维素滤膜过滤后，喹诺酮类抗生素经固相萃取柱富集、洗脱和净化后，供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4 试剂和材料4.1 甲醇（CH3OH）。4.2 乙腈（CH3CN）。4.3 甲酸（HCOOH）。4.4 乙酸铵（CH3COONH4）。4.5 氨水（NH3H2O）：优级纯。4.6 5 mmol/L乙酸铵缓冲液：称取0.1925 g乙酸铵（4.4），溶于500 mL水中。用甲酸（4.3）调节pH为30.05。4.7 5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水（4.5），用甲醇稀释并定容至100 mL。4.8 0.1%甲酸水溶液：量取1mL甲酸（4.3），用水稀释至1000 mL。4.9 0.1%甲酸水-乙腈：（9+1，体积比），量取90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和10mL乙腈（4.2）混合。4.10 标准物质：恩诺沙星（Enrofloxacin）、诺氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依诺沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixic acid）、恶喹酸（Oxolinic acid）、氟甲喹（Flumequine）、丹诺沙星（Danafloxacin）、双氟沙星（Difloxacin）、奥比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、氟罗沙星（Fleroxacin），纯度97.0%。4.11 内标物质：氘代诺氟沙星，氘代环丙沙星、氘代恩诺沙星，纯度97.0%。4.12 喹诺酮类标准储备溶液：分别称取适量喹诺酮类标准品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，使各种喹诺酮的浓度均为1.0 mg/mL。-18以下避光保存，有效期6个月。4.13 内标标准储备溶液：分别称取适量内标标准品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，使各种内标浓度均为1.0 mg/mL。-18以下避光保存，有效期6个月。4.14 混合标准中间溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.12)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制成浓度为1 g/mL的混合标准中间溶液。-18以下避光保存，有效期3个月。4.15 混合标准工作溶液：根据需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合标准中间液（4.14）稀释成合适的混合标准工作溶液，现配现用。4.16 混合内标标准工作溶液：分别量取适量标准储备溶液(4.13)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释配制成浓度为1 g/mL的混合内标标准工作溶液。-18以下避光保存，有效期3个月。注：除另有说明外，以下所用的试剂均为色谱纯，试验用水为GB/T 6682 规定的一级水。5 仪器和设备5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)。5.2 天平：感量0.01 g。5.3 分析天平：感量0.00001 g。5.4 涡旋混合器。5.5 氮吹仪。5.6 pH计：测量精度0.05。5.7 刻度玻璃离心管：10 mL。5.8 混合纤维素滤膜：0.45 m。5.9 水系滤膜：0.22 m。5.10 固相萃取柱：HLB固相萃取柱：500 mg，6 mL，或性能相当者。5.11 固相萃取装置。6 样品制备与保存采集的渔业养殖水样经0.45 m混合纤维素滤膜过滤。如水样较浑浊，可更换滤膜或过滤2次。过滤后的水样于4密封保存，24 h内进行检测。取过滤后的供试样品，作为供试试料。取过滤后的空白样品，作为空白试料。取过滤后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。7 测定步骤7.1 提取和净化依次用6 mL甲醇，6 mL超纯水，6 mL 5 mmol/L乙酸铵缓冲液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200 mL过滤后的试样，加入适量甲酸调节水样pH为3.00.05，准确加入1g/mL混合内标标准工作液50 L（4.16）。然后以约35 mL/min流速通过固相萃取柱（5.10）。过柱后用6 mL超纯水淋洗，再将小柱于氮气保护下干燥20 min，最后用6 mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分两次进行洗脱。洗脱液于40水浴用氮气吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1 mL，涡旋混匀1 min，过0.22 m水系滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.2 标准曲线的制备精确量取适量混合标准中间溶液(4.14)和适量1 g/mL混合内标标准工作液（4.16），用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）配制成同位素内标浓度为50 ng/mL以及16种喹诺酮浓度为1、5、10、20、50、100和200 ng/mL系列标准溶液。以被测组分和相应内标的峰面积比值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。7.3 测定7.3.1 色谱参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：EC-C18柱，(2.1 mm x100 mm，2.7 m)，或性能相当者。b) 流速：0.40 mL/min。c) 柱温：30。d) 进样量：10 L。e) A为0.1%甲酸水溶液 (4.8)，B为乙腈(4.2)；梯度洗脱程序见表1。表1 流动相梯度洗脱程序时间/minA相/%B相/%0.009552.00851510.00455512.00109013.0095515.009557.3.2 质谱参考条件质谱参考条件如下：a) 离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；b) 喷雾电压：5500 v；c) 气帘气流量：2L/min；d) 雾化气流量：8 L/min；e) 辅助加热气流量：8 L/min；f) 离子源温度：500；g) 扫描模式：多反应监测(MRM)，扫描参数见附录A；7.3.3 定性测定在同样测试条件下，试样溶液中各抗生素的保留时间与标准物质保留时间相对偏差在2.5%以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相当的标准溶液中定性离子的相对丰度一致。基峰与次强碎片离子丰度比应符合表2要求。各抗生素的保留时间参考附录 B。表2 基峰与次强碎片离子丰度比要求次强碎片离子相对丰度 %502050102010允许相对偏差 % 20 25 30 507.3.4 定量测定将标准工作液和试样溶液等体积进样测定，按内标法进行定量分析，在样品中加入回收率指示物，以此来保证整个样品前处理过程的回收率。诺氟沙星、依诺沙星以氘代诺氟沙星为内标，环丙沙星、洛美沙星以氘代环丙沙星为内标，恩诺沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、司帕沙星、双氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟罗沙星、奥比沙星以氘代恩诺沙星为内标。7.3.5 空白试验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。8 结果计算试样中喹诺酮类抗生素含量按公式(1)计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。（1）式中：Xi 试样中喹诺酮类抗生素含量，单位为纳克每升(ng/L)；ci 试样溶液中喹诺酮类抗生素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；V1 试样溶液最终体积，单位为毫升(mL)；m 试样体积，单位为升(L)。9 方法灵敏度、准确度和精密度9.1 灵敏度本方法的定量限为10 ng/L。9.2 准确度本方法回收率范围为70%120%。9.3 精密度本方法的批内变异系数15%，批间变异系数15%。附 录 A（资料性附录）扫描参数表A.1 16种喹诺酮类抗生素及内标物的母离子、子离子和碰撞能量序号化合物母离子/(m/z)子离子/(m/z)碰撞能量/V1恩诺沙星36024538316*262诺氟沙星32023335276*263培氟沙星33429027316*304环丙沙星33224532288*265氧氟沙星36226126318*386沙拉沙星38629936342*267依诺沙星32123244303*308洛美沙星35226533308*289萘啶酸233.3215.228187.4*4410恶喹酸26221639244*2611氟甲喹26220225244*4012丹诺沙星35828330340*2413双氟沙星40029938356*3014奥比沙星39629535352*2615司帕沙星39329235349*2716氟罗沙星37026937326*2717氘代诺氟沙星3253073018氘代环丙沙星3403222819氘代恩诺沙星36532129注：*为定量离子附 录 B（资料性附录）标准溶液液相色谱/串联质谱色谱图和参考保留时间图B.1 16种喹诺酮标准工作溶液液相色