江苏地方标准 DB 32 3762.3-2020新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序

ICS11.020C 62DB32江苏省地方标准DB 32/T 3762.32020 新型冠状病毒检测技术规范第3部分：核酸荧光PCR检测程序 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 3: Real-time fluorescence PCR test procedure 2020 - 03 - 02发布2020 - 03 - 03实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T 3762.32020前言DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范目前分为以下部分：第1部分：生物样本采集、运输和保存；第2部分：病毒分离与鉴定； 第3部分：核酸荧光PCR检测程序；第4部分：重组酶介导等温扩增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序；第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序；第7部分：空气样本检测与评估；第8部分：物体表面检测与评估；第9部分：医务人员职业暴露检测与评估。本部分为DB32/T 3762 的第3部分。本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本部分由江苏省卫生健康委员会提出。本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、昆山市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：崔仑标、朱宝立、朱小娟、葛以跃、程军平、徐佳南、钱志远、罗晓明、沈欢喜。4新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序1 范围本部分规定了新型冠状病毒实验室核酸荧光PCR检测环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、样本前处理与核酸提取、扩增体系配制与扩增、结果判定。本部分适用于新型冠状病毒实验室核酸荧光PCR检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求医疗机构临床基因扩增管理办法 原卫生部办公厅医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原卫生部检验中心新型冠状病毒实验室生物安全指南 国家卫生健康委3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1荧光PCR real-time fluorescence PCR一种新型定量试验技术，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样本模板的初始浓度，用于鉴别病原微生物。4 环境与设施4.1 实验室资质及级别要求应按照新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（BSL-2）进行，同时采用生物安全三级实验室（BSL-3）的个人防护；感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测操作应在BSL-2进行。核酸扩增应在基因扩增实验室进行,临床检测机构基因扩增实验室应满足GB 19489、医疗机构临床基因扩增管理办法、医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则相关要求。4.2 操作人员资质及防护要求实验操作人员应经过生物安全培训并取得上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。操作人员按BSL-3级实验室个人防护的要求进行防护，需配备N95及以上级别防护口罩、医用无纺布帽、护目镜或防护面屏、连体防护服、一次性手术衣、一次性PE手套、乳胶手套、 鞋套、防水靴套等防护装备。5 设备与耗材5.1 设备生物安全柜、离心机、涡旋振荡器、水浴或金属浴、核酸提取仪、荧光定量PCR仪。5.2 耗材N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、连体防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶手套、防水靴套、微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、1.5 mL EP管、冻存管、冻存盒。6 试剂与材料6.1 试剂核酸提取试剂盒、新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒。6.2 材料消毒剂：75%乙醇；有效氯5500mg/L的消毒液（需每天新鲜配制）；生理盐水或磷酸盐缓冲液（PH=7.4）；4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液或0.1%二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液。7 样本前处理与核酸提取7.1 样本前处理7.1.1 进入BSL-2实验室，需由两人同时操作。7.1.2 在生安柜内打开第二层包装，取出待检样本，核对送检单，若管壁外有不明液体，应用含氯消毒液擦拭。7.1.3 样本灭活：56水浴或金属浴灭活30 min。7.1.4 特殊样本处理：痰液样本：加入检测等体积4%NaOH或含1g/L蛋白酶K的磷酸盐缓冲液或0.1%二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液室温放置15min20 min液化痰液；粪便样本：以生理盐水或磷酸盐缓冲液制备10%的便悬液，轻轻吹吸35次， 静止 10 min，8000 rpm 离心 5 min，在生物安全柜中取上清进行下一步试验。7.1.5 将样本混匀后分装于2 mL带螺旋盖内有垫圈冻存管。在冻存管上标记，注明姓名、样本类型、日期等。吸取部分样本进行核酸提取。所有冻存管旋紧管盖后需用封口膜密封。7.2 核酸提取7.2.1 核酸提取按照核酸提取试剂盒或核酸提取仪操作说明进行。7.2.2 取出提取好的核酸，转入1.5 mL EP管，注明姓名、样本类型、日期等。7.2.3 将核酸管放入核酸转运盒，连同样本转运盒进行盒内外消毒后转出生安柜。7.2.4 实验结束后，生安柜内清场：使用后的核酸提取条/板放入垃圾袋，包扎垃圾袋，含氯消毒液喷洒消毒外表面，将一次性软吸收垫喷洒含氯消毒液后折叠。手消毒后将垃圾袋和一次性软吸收垫一起带出生安柜放入核心区中号垃圾袋。试管架，试验台面、移液器等喷洒含氯消毒液消毒30 min后用清水擦拭。关闭生安柜，紫外灯消毒30 min。7.2.4.1 消毒一次性手术衣、脱一次性手术衣放入中号垃圾袋，包扎垃圾袋。消毒垃圾袋外表面、核酸和样本转运盒。退出核心区，将中号垃圾袋放入缓冲区大号垃圾袋内。7.2.4.2 每日固定时间对核心区进行过氧化氢终末消毒，消毒前应以塑料袋覆盖机器如核酸提取仪、离心机等，记录终末消毒记录。7.2.4.3 在缓冲区按合理程序脱卸个人防护用品。脱内层手套前开启核心间紫外灯消毒30 min。7.2.4.4 出缓冲区，开启缓冲区紫外灯消毒。将垃圾袋放入高压灭菌器中121，30 min，并记录。7.2.4.5 将核酸交核酸检测人员。样本转入病毒样本专用专人保管冰箱。8 扩增体系配制与扩增8.1 按所用检测试剂盒说明书配制荧光PCR扩增体系，至少建立2套荧光PCR扩增体系。8.2 在生安柜内加核酸模板，然后进行荧光PCR扩增。8.3 在实验记录本记录加样位置和样本编号。8.4 未用完核酸样本转入病毒样本专用专人保管冰箱。8.5 按所用试剂盒说明书在仪器上设置扩增参数进行扩增。9 结果判定9.1 阈值设定阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。9.2 质控标准9.2.1 样本内参基因要求样本内参RNP基因出现典型的扩增曲线呈S型，且Ct值小于或等于35。9.2.2 一般要求检测结果中的阴、阳性对照均符合以下情况，如对照不成立，此次试验视为无效。9.2.3 阴性对照阴性对照无扩增曲线，或Ct值大于40。9.2.4 阳性对照阳性对照出现典型的扩增曲线呈S型，且Ct值小于或等于30。9.3 结果判断9.3.1 阳性判定：实验室确认阳性病例需满足以下两个条件中的一个：a) 同一份样本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。如果仍然为单靶标阳性，判定为阳性。b) 两种不同类型样本实时荧光RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型样本两次采样检测中均出现单个靶标阳性的检测结果，可判定为阳性。9.3.2 阴性判定：在对照成立下，如果样本检测没有出现扩增曲线，或Ct值大于40，则判定为阴性。9.