1.2基因工程的基本操作程序ppt课件

1.2基因工程的基本操作程序,1,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,2,为什么要有“目的基因的获取”这一步？,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,一、目的基因的获取,3,真核细胞的基因结构,什么是“目的基因”？,原核细胞的基因结构,4,目的基因主要是_，也可以是一些具有调控作用的因子,编码蛋白质的结构基因,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、种子贮藏蛋白基因及人胰岛素基因等。,5,1）从基因文库中获取目的基因,获得目的基因的方法,2）利用PCR技术扩增目的基因,未知目的基因的核苷酸序列,已知目的基因的核苷酸序列,3）人工合成,且基因比较小,且基因比较大,6,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,1.基因文库概念,7,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,8,3、基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物全部DNA,用适当限制酶切割,许多DNA片段,与载体连接导入受体菌群,该生物基因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,与载体连接导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA(cDNA),该生物cDNA文库,9,基因组DNA文库,cDNA文库,10,真核生物转录过程,11,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物部分基因,某种生物全部基因,小,大,无,有,无,有,可以,部分基因可以,12,村长,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？,当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全不知道目的基因序列，或者想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在不同的发育阶段都表达哪些基因，或者想得到一种生物的全部基因序列，往往就需要构建基因文库。,4.基因文库的目的,13,1、概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,2、原理：,DNA复制,利用PCR技术扩增目的基因,14,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),4、条件：,一小段单链DNA或RNA，一般2030个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。,已知目的基因的核苷酸序列,3、前提：,温度控制,15,PCR扩增仪,5、方式：,指数,2n,6、结果：,使目的基因的片段在短时间内大量地扩增,以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,16,扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,17,PCR仪,微量离心管,18,一次性吸液枪头,调节轮,卸枪头按钮,推动按钮,卸枪头器,微量移液器,19,利用PCR技术扩增目的基因,20,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,21,通过DNA合成仪用化学方法人工合成,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,DNA合成仪,22,为什么要有“表达载体的构建”这一步？,单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。,构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。,23,1.用一定的_切割载体，使其出现一个切口，露出_。2.用_切断目的基因，使其产生_。,核心,3.将切下的目的基因片段插入载体的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,二、基因表达载体的构建,24,基因表达载体的组成：,c、目的基因,b、启动子,d、终止子,e、标记基因,a、复制原点,25,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,26,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,27,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,28,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,29,基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体-DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,30,花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加表达载体-DNA，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,31,显微注射法,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,32,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,1.常用菌：,感受态大肠杆菌细胞,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,33,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,DNA分子导入受体细胞后就说明目的基因完成了表达吗？,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,34,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,分子检测,个体鉴定：,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,35,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,报告基因（含荧光素分子）,变性,DNA杂交（如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,36,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,37,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,38,39,基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定,40,思考：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,41,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,42,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,酚类化合物,43,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,44,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,45,1.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,46,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是A提高受体细胞在自然环境中的耐药性B有利于对目的基因是否导入进行检测C增加质粒分子的分子量D便于与外源基因连接4.有关基因工程的叙述正确的是A限制酶只在获得目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可作为运载体D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,47,5.哪项不是基因表达载体的组成部分()A.启动子B.终止密码C.标记基因D.目的基因6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()A基因枪法B显微注射法C.农杆菌转化法D花粉管通道法,48,(多选)采用基因工程的