第二章__昆虫解毒代谢

1.前言2.初级代谢(1)氧化代谢（MFO)(2)非氧化代谢I.水解代谢（酯酶）II.还原代谢（硝基还原酶）3.次级代谢4.有毒物质在昆虫体内代谢,第二章：昆虫解毒代谢,第一节前言,一、研究昆虫解毒代谢的意义二、昆虫对毒物的代谢I.解毒作用：有毒物质进入昆虫体内，昆虫体内有多种防御机能，能将有毒物质迅速代谢为无毒物质，使机体保持正常状态而不受其害，这种代谢称为解毒作用。II.活化作用：有些化合物在生物体内，经代谢转化成比原化合物更毒的物质，这种代谢称为活化作用。,I.昆虫解毒代谢的类型：(1)初级代谢（型反应）：主要包括对外来化合物的氧化、水解、还原以及基团的转移。(2)次级代谢（型反应）：初级代谢的产物（主要具有-OH、-SH、-NH2、-COOH的基团）与内源物质（轭合剂）结合，最后排除体外。农药在昆虫体内的轭合形式主要是氨基酸反应，包括与单氨基酸类的轭合和复氨基酸的轭合、及与硫酸酯的轭合、与谷胱甘肽的轭合、烷基化和酰化反应等。轭合后的轭合物比农药本身的亲水性更强，更容易从动物体内排出。,药物杀虫剂其它外来化合物,初级产物,次级产物,初级代谢,氧化、还原、水解、基团转移,次级代谢,葡萄糖、氨基酸、硫酸、磷酸等共轭,脂溶性,水溶性,第二节氧化代谢（MFO),氧化代谢中所涉及到的酶系很多，主要有：脱氯化氢酶（deyudrochlorinase）、微粒体多功能氧化酶（microsomalmixed-functionoxidases，MFO）、谷胱甘肽转移酶（glutathione-transferases，GST）及各种酯酶（esterases）等。其中微粒体多功能氧化酶具有底物广谱性的特点，能参与对各种杀虫剂（包括有机氯、有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、化学不育等等）及有毒物质的解毒作用，在有毒物质代谢中起着非常重要的作用。,一、微粒体多功能氧化酶作用方式及机理,(一)微粒体多功能氧化酶研究历史1.1943年Claude把通过差速离心分离出来的亚细胞颗粒（直径约200m）称之为微粒体。2.1954年Axelrod首先发现兔肝微粒体对苯异丙胺具有脱氨氧化作用，此后人们才开始注意到微粒体在氧化代谢中的重要作用。3.1958年，Brodie等证明了离体的微粒体氧化酶要起作用，需要氧和还原性辅酶（NADPH）4.昆虫中的微粒体氧化酶是Agosin等于1961年首次在德国蜚蠊中发现的。,（二）微粒体多功能氧化酶的组成及性质,MFO是一个酶的复合体，主要包括：细胞色素P450、黄素蛋白-NADPH-P450还原酶、细胞色素b5、黄素蛋白-NADH-细胞色素b5还原酶和磷脂等成分组成。,1.细胞色素P450的特性,(1)光学特性微粒体被还原后可以与CO结合形成复合体，通过双光束扫描分光光度计扫描，在波长450nm处出现一个最大吸收峰。除了与CO结合外，细胞色素P450可以与许多物质结合，结合后所诱导产生的光谱，按其性质可分为三类：型：波峰在390-410，波谷在425-435nm；型：波峰在425-435nm，波谷在390-410nm；M型：最大和最小吸收峰分别在325和420nm。,棉铃虫中肠细胞色素P450CO差光谱图,棉铃虫中肠CytP420-CO差光谱,(2)不稳定性,差速离心,P450s的氨基酸同源性大于40时为同一家族；若大于55%时为同一亚家族若大于55%时为同一亚家族，大于80属于等位基因，大于97属于等位基因的变异体。等位基因用v1、v2等表示，假基因用p1、p2等表示。例外：CYP6A1和CYP6B2虽属于同一6家族，但是这两个蛋白的氨基酸的同源性却低于40,(3)命名,(4)多样性,P450基因已经有35亿年的历史。现在所有的p450s均来自一个共同的古老的基因。现在认为当前p450超家族是通过基因扩增或基因适应多样化形成的。P450基因属于基因超家族(superfamily)，目前已知，该超家族包括70个家族(family)，120个亚家族(sub-family)（Nelson,1998），并且不断有新的成员加入，其数量增长很快。,到目前为止，p450超家族已发现1200种基因，哺乳动物中有大约310种。到2000年春季，植物中已知的p450基因有513种。细菌和低等的真核生物中的p450有接近100种已命名。人类有56种。,(I)p450家族数目,(II)P450s的进化,分子驱动学说指出，一个种群基因型组分的改变是由于DNA翻转内在的动力而非自然选择造成的。假基因是一段与功能基因相似的序列，但不能形成蛋白产物。假基因的识别要么通过编码区的异常或转录的异常，或两者兼有。,(III)同工酶的多样性,果蝇基因组的序列揭示了在果蝇中有86个公认的p450基因，4个假基因，归属25个不同的家族。来自家族4与6的基因数目大约占这个中群p450s的一半多。在86个基因中，CYP6A17和CYP6A23具有最高的相似性，达到84.2。仅有10对的相似性大于70。,其表达与昆虫的发育阶段、性别、组织、品系及取食有关。,(IV)表达的多样性,细胞色素P450基因调控的多样性,(5)可诱导性,现已证明，许多化合物，如药物、杀虫剂、以及植物他感化和物都能诱导P450的生物合成。目前搞的比较清楚的是苯巴比妥和3-甲基胆蒽可诱导P450的合成。,槲皮素（0.01%和0.02%）对棉铃虫幼虫P450s诱导的时间效应,单宁（0.1%和0.5%）对棉铃虫幼虫P450s诱导的时间效应,十三烷酮(0.02%)对棉铃虫中肠细胞色素P450的诱导作用时间4162640507296CK中肠1.502.292.243.072.584.322.581.22倍数1.221.871.842.512.113.532.11,(6)分离昆虫p450s的方法,1全基因测序2蛋白纯化3用已知的p450s作为探针4利用兼并引物5差异或消减筛选,P450纯化可通过两个途径:(1)直接从生物体组织中分离，(2)通过分子生物学方法获得P450基因，再进行异源表达纯化P450蛋白。从生物组织中直接分离P450蛋白一个首要解决的问题就是需要大量的组织材料.另外生物体内蛋白种类多，要经过繁琐的步骤进行分离.这样容易造成P450蛋白失活，而通过P450差光谱就很难鉴定。通过P450其它种类已分离450蛋白的抗血清或特异性抗体加以解决。,P450蛋白纯化的研究,实验流程,分离昆虫p450s的方法,家蝇CYP6A1和果蝇CYP6A2的cDNA文库就是通过p450的抗体筛选得到的cDNA文库。CYP6B3就是通过用CYP6B1CDNA为探针分离得到的。,(7)昆虫p450s的底物,昆虫单加氧酶可代谢内源性物质诸如保幼激素、蜕皮激素及其类似物等，也可代谢外源物质如次生物质、杀虫剂及前诱变剂。,2.细胞色素P450酶系氧化底物循环作用机理,(1)底物与酶结合，酶上的铁原子由于NADPH-细胞色素P450还原酶供给一个电子使得三价铁还原为二价铁。(2)铁的还原作用使其与分子氧结合。(3)另一个电子和质子加到铁上形成FeOOH复合体。(4)失去一分子水后形成（FeO）3+复合体，此复合体将其氧原子转移到底物上。(5)被氧化的底物释放出来，游离的细胞色素P450又重复下一个循环。,MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450,MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450,MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450,催化反应机制,RH+O2+NADPH+H+ROH+H2O+NADP+这一循环开始于酶作用物与亚铁血红素的结合，通常诱导铁旋转状态由低自旋到高自旋底改变。铁通过从氧化还原配耦体转移出一个电子被还原成亚铁形式并和氧迅速结合。第2个电子转移到亚铁血红素导致氧分子分裂成瞬时底介体并释放水。最终，活泼底介体攻击酶反应物导致化合物单加氧化。,P450对底物的氧化循环机理,Fe3+P450,底物,OH,FeOOHP450,底物,H,Fe2+O2P450,底物,H,Fe2+P450,底物,H,Fe3+P450,底物,H,Fe3+P450,底物,OH,底物,H,(FeO)3+P450,底物,H,H+,H2O,H+,1,NADPH,e-,NADPH,e-,O2,3从p450s研究中获得信息,(1)杀虫剂抗性(2)植物昆虫相互作用(3)昆虫生理知识,植物昆虫相互作用,黑尾凤蝶能够取食含有呋喃香豆素的大多数植物，并能忍受含有0.1花椒毒素。在这个种中，花椒毒素可被p450单加氧酶代谢，诱导的p450的活性接近5倍。,二、多功能氧化酶作用方式,O、S和N-烷基的羟基化作用脂族羟基化作用和环氧化作用芳香族羟基化作用有机磷酸酯的脂族氧化作用氮和硫醚的氧化作用,MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450,1.O、S和N-烷基的羟基化作用（西维因的N-烷基羟基化作用）,西维因,1-萘基-N羟基-氨基甲酸甲酯,O、S和N-烷基的羟基化作用（西维因的N-烷基羟基化作用）,MonooxygenationreactionscatalysedbycytochromeP450,2.脂族羟基化作用和环氧化作用,DDT,三氯杀螨醇,OH,H,MFO,(1)DDT的羟基化作用,艾氏剂,狄氏剂,.芳基羟基化作用和环氧化作用,2.艾氏剂的环氧化作用,MFO,O,NADPH,O2,微粒体,萘,1，2-二羟基-1，2-二氢化萘,-萘酚,芳香族羟基化作用萘的羟基化作用,NADPH,O2,NADPH,O2,对硫磷,二乙基硫代磷酸,4-硝基酚,有机磷酸酯的脂族氧化作用（对硫磷）,NADPH,O2,NADPH,O2,甲基对硫磷,二甲基硫代磷酸,4-硝基酚,有机磷的脂族氧化作用（甲基对硫磷）,MetabolicdisorderscausedbymutationsandpolymorphismsinP450oxidoreductase,MostdrugsandxenobioticsaremetabolizedbyasmallnumberofhepaticcytochromeP450enzymes.AlldrugmetabolizingP450enzymesreceiveelectronsfromNADPHthroughasingleflavoproteinknownasNADPH-P450reductase.WehaverecentlyidentifiedmutationsinNADPHP450reductasefrompatientswithdisorderedsteroidogenesis.Polymorphismsinthedrugmetabolizingenzymes,especiallycytochromeP450sarewellknowntoberesponsibleforvariationsindrugresponses.MypreliminaryworkonmutantandpolymorphicP450reductasesuggeststhatmanydrugmetabolizingP450enzymesareseverelyaffectedbyanabnormalP450reductaseenzyme.,SinceallliverP450enzymesneedP450reductaseforactivity,itisseemslikelythatchangesinP450reductasemayproducedrugresponsesthatarephenotypicallysimilartooneormorecytochromeP450mutations/polymorphisms.Asanexample,inthefirstreportofP450reductasemutations,thediseaseprohormonallyimpairedpatientssuggestedadefectinP450c17orP450c21butnomutationinanyoftheseenzymeswasfoundanditwasthedefectiveP450reductasethatproducedaphenotypicresponsesimilartodefectiveP450c17andP450c21.SequencingdatafromnormalpopulationhasrevealedseveralvariantsofNADPHP450reductaseenzyme.TheseP450reductasevariantsarebeingtestedfortheelectrontransferactivitiestowardsvariouscytochromeP450enzymes.FirstsetofP450reductasemutationshadbeentestedforactivitytowardsP450c17andaromatase(CYP19A1).,第三节：有毒的其它初级代谢一：杀虫剂的水解代谢,A酯酶主要是芳基酯酶，能水解某些含芳基的磷酸酯类杀虫剂，B酯酶包括了胆碱酯酶，羧酸酯酶核酯酶。,Aldridge（1953）根据酯酶与有机磷的相互作用把酯酶分为三类：,(1）A-酯酶，这类酶能耐受有机磷，并把它们作为底物进行水解；,(2）B-酯酶，这类酶对对氧磷等有机磷很敏感，能被这些有机磷抑制；,(3）C-酯酶，既不被有机磷抑制，又不能水解这些有机磷。,杀虫剂的水解代谢主要包括：（一）磷酸三酯的水解（二）羧酸的水解（三）酰胺的水解,（一）磷酸三酯的水解磷酸三酯能够被磷酸三酯水解酶水解。此酶主要作用于磷酯和酐键。在以前用了很多名字描述这种酶，例如：对氧磷酶、A酯酶、磷酸酯酶、磷酰基磷酸酶、芳基酯酶等，实际上都属于磷酸三酯水解酶。一般，水解磷酸酯酶系大多是根据其水解底物的名称来命名的。目前发现的水解酶主要包括：DFP酶、芳族酯水解酶、O-烷基水解酶、磷酸二脂水解酶。1.氟水解酶(Fluorohydrolases,DFP酶)2.芳族酯水解酶3.O-烷基水解酶4.磷酸二脂水解酶,（一）磷酸三酯的水解,+H2O,+HX,+H2O,+ROH,1.磷酸三酯的水解,+H2O,+HF,氟水解酶（DFP酶）,H2O,+,2.芳族酯水解酶,OH,HO,H2O,+CH2OH,3.O-烷基水解酶,DDVP,+H2O,+,4.磷酸二酯的水解,HO,HOCH=CCL2,（二）羧酸的水解羧酸酯酶(Carboxylesterase)，属于B酯酶，又称脂族酯酶，能催化各种脂族酯和芳族酯的水解，但不能水解胆碱酯。目前研究表明羧酸酯酶在一些有机磷和拟除虫菊酯的代谢中起着重要的作用，这种酶的活性一般在正常的昆虫品系中是比较低的而在某些抗性品系中比较高。羧酸酯酶通过附加一分子水而将底物裂解成酸和醇两部分。例如：将马拉硫磷水解，形成，单酸以及醇。,（二）羧酸的水解,H2O,+2C2H5OH,马拉硫磷,马拉硫磷-单酸,马拉硫磷-单酸,+,（三）酰胺的水解,H2O,+CH3NH2,乐果,乐果酸,酰胺酶可以水解含酰胺键的化合物。例如将乐果水解成乐果酸。,（四）环氧化物水解环氧化物的水解由环氧化物水解酶催化，昆虫中存在家蝇、红头丽蝇、黄粉甲、亚热带粘虫,H2O,二还原代谢还原代谢没有氧化代谢那么普遍。在动物体内这种代谢多发生于那些含硝基苯核或含卤原子的化合物，在酶或细菌的作用下，被转化为相应的氨基化合物及脱卤代谢物。如：DDT转变为滴滴伊的反应，就是通过脱氯化氢酶的作用，一个卤原子被氢所取代。含硝基苯母核的农药，如：苯硫磷、对硫磷、杀螟松等化合物在动物体内容易被还原为氨基衍生物。在昆虫中发现了硝基还原和偶氮还原两类。如对硫磷在依赖于NADPH的硝基还原酶的作用下被还原成胺基对硫磷。,二、还原反应,对硫磷,氨基对硫磷,NADPH,硝基还原酶,NH2,NO2,三以谷胱甘肽为介质的代谢许多外来化合物的代谢都与谷胱甘肽（GSH）有关，杀虫剂以及其代谢产物也能够被以谷胱甘肽为介质的系统代谢。这种代谢有两类，第一是GSH以纯粹催化剂的形式被利用；第二谷胱甘肽直接与底物结合而被消耗，至少在反应初期是这样的，并不能再生，而是排除体外。,X-raystructureofglutathioneS-transferasefromthemalarialparasitePlasmodiumfalciparum,X-raystructureofglutathioneS-transferase,X-raystructureofglutathioneS-transferase,单体,双体,（一）谷胱甘肽催化代谢DDT脱HCl,C,Cl-,-Cl,C,+GSH,+HCl+GSH,(二)GSH消耗代谢GSH-S-转移酶此酶属于共轭反应类型，在以后还会介绍。GSH和底物结合，一般有两种类型。第一：GSH代替底物中不稳定的部分：第二：直接进攻底物分子二乙基顺丁烯二酸,1.GSH-S-烷基转移酶,GSH,+CH3-SG,甲基对氧磷,2.GSH-S-芳基转移酶,二嗪农,+,3.GSH-S-芳烷基转移酶,+GSH,+HCl,苄基氯,4.GSH-S-链烯转移酶,+GSH,二乙基马来酸酯,以下两类反应是通过GSH-S-转移酶直接将GSH转移到底物分子中,5.GSH-S-环氧基转移酶,+GSH,1,2环氧乙基苯,第四节杀虫剂的次级代谢(共轭代谢)次级代谢（型反应）：初级代谢的产物（主要具有-OH、-SH、-NH2、-COOH的基团）与内源物质（轭合剂）结合，最后排除体外。农药在昆虫体内的轭合形式主要是氨基酸反应，包括与单氨基酸类的轭合和复氨基酸的轭合、与硫酸酯的轭合、与谷胱甘肽的轭合、烷基化和酰化反应等。轭合后的轭合后的轭合物比农药本身的亲水性更强，更容易从动物体内排出。,一、共轭反应共轭反应主要指天然的或外来的化合物及其代谢物与内源性的中间产物结合。具有中间代谢和解毒的双重作用在昆虫中主要有三种类型的共轭反应。,1.外来化合物或其代谢产物和内源性的活化供体反应,要求外来化合物或其它代谢产物有-OH，NH2，SH，-COOH基团，这些基团与尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）反应。,-萘酚+UDPG(活化供体),-萘基葡萄糖苷,2.外来化合物活化成活化的供体，然后和内源性受体酶促反应,对硝基苯甲酰CoA（活化供体）,对硝基苯甲酸,活化,CoA,甘氨酸,共轭,对硝基苯甲酰甘氨酸,3.外来化合物或其产物与GSH酶促反应,在第一种和第二种类型的共轭反应中，需要形成高能量的或活化的中间产物，虽然第三种类型不需要但它反应所需要的GSH的合成需要ATP。因此，总的来说，共轭代谢是需要额外能量的。,苄基氯+GSH,苄基SG,（二）