卵黄免疫球蛋白的分离提取与鉴定.docx

卵黄免疫球蛋白的分离提取与鉴定宋宏新高栋薛海燕（陕西科技大学生命科学与工程学院咸阳712081）摘要：对氯仿法、辛酸法、水稀释法、水 -辛酸法分离卵黄免疫球蛋白(IgY)进行了比较，结果表明:水-辛酸法在 9 倍稀释度、pH5.3、辛酸加量 1%条件下，可获得较好效果，进一步用硫酸铵沉淀脱 盐后，提取率达 93.4%，产率达 4.67mg/mL 卵黄，纯度达 85%。关键词：卵黄免疫球蛋白；水-辛酸法；提取；鉴定中图分类号：TS201.2文献标识码：A文章编号：1005-9989(2003)05-0099-03Extraction and Identification of Immunoglobulin of YolkSONG Hong-xin GAO Dong XUE Hai-yan（Life Science Engineering College, Shanxi University of Science and Technology, Xianyang,712081）Abstract: This study was a comparison of reported methods of extraction of IgY from hen egg yolk. Four methods of lipid removal were compared, followed by a method of immunoglobulin precipitation. The results showed that the method of water-caprylic acid was the best one, the extraction ratio of IgY was 93.4%, and the yield was 4.67mg/mL yolk, the purity was 85%.Key words: IgY; water-caprylic acid;extraction;identification0前言目前，抗体在疾病的治疗、诊断及医药食品的检 验中被广泛地使用。寻找一种经济、快速、高效的生 产提取方法，有着广阔的前景。卵黄免疫球蛋白就是 卵黄中的-卵黄球蛋白，由于其蛋白质的物理化学 性质、免疫学性质等方面与哺乳动物 IgG 存在一定差 异，所以在免疫学领域把由鸡卵黄中获得的抗体称为 卵黄免疫球蛋白（Immunoglobulin of Yolk，以下简称 IgY），IgY 的应用主要在于疾病的诊断检测和防治1、 兽医临床2、食品添加剂2及化妆品领域3等。1材料与方法1.1主要试剂法氏囊病毒(IBDV)中等毒力活疫苗：中牧股份 南京药械厂；IBDV 琼扩抗原：中国兽药监察所； 标准鸡抗体：鼎国生物产品发展中心；兔抗鸡 IgG 抗血清：鼎国生物产品发展中心；IBDV 阳性血清： 中国兽药监察所。1.2高免鸡蛋的制备首免采用饮水免疫法，IBDV 弱毒苗用 5 倍剂量；10 d 后 2 免，弱毒苗 10 倍剂量，再加上油乳剂 灭活苗进行肌肉注射；再过 10d 进行 3 免，方法同2 免，只是弱毒苗用量增为 20 倍剂量；然后再根据 具体效价变化进行第 4 次免疫。1.3 IgY 的分离1.3.1 氯仿抽提法4 取卵黄原液，加入 0.8%PBS 溶液稀释，用漩涡混合仪混合均匀至无明显大块卵 黄液。在搅拌的情况下缓慢加入氯仿，混匀后静置，4过夜。4000r/min 离心 20min，上层水相即为所 要分离的 IgY 初提液。辛酸法5取卵黄原液，加入 0.8%PBS 溶液1.3.2稀释，用漩涡混合仪混合均质，加入正辛酸使终浓度为 1%，静置。4500r/min 下离心 20min。离心后 分成 4 层，抽取第 3 层清液，即为 IgY 初提液。法)61.3.3水稀释法(WD取一定体积的卵黄原液，加 9 倍于卵黄原液体积的蒸馏水，混匀。用稀酸调 pH 至 5.3，静置。8000r/min 下离心 30min，上 清液即含有所要分离的水溶性 IgY。1.3.4水-辛酸法于水稀释法所制得的上清液中缓慢加入 1%的正辛酸，搅拌 10min，放入冰箱冷冻收稿日期：20021230作者简介：宋宏新(1959-)，男，教授，主要从事生物化学与分 子生物学、食品科学方面的教学和科研工作。营养研究10min，抽滤得 IgY 初提液。1.4IgY 的提取硫酸铵沉淀法7。分别调节50%饱和硫酸铵溶液 和上述方法得到的 IgY 初提液至 pH5.3。在 IgY 初 提液中缓慢加入相同体积的50%硫酸铵溶液，4过 夜。离心弃去上清液后，用 0.8%PBS 重新悬浮沉淀 至初体积，再在搅拌下加入初体积一半的 33%的饱 和硫酸铵溶液，静置 1h。再次离心，弃去上清液。 用 0.8%PBS 重悬沉淀，得 IgY 溶液。离提取是至关重要的，所以，第一步必须除去高浓度的脂类物质。实验进行了 4 种去脂方法的比较， 即氯仿法、辛酸法、水稀释法和水-辛酸法，4 种方 法各有优势，其去脂效果比较见表 1。表 1 不同方法的去脂效果比较去脂方法氯仿法 辛酸法 水稀释法 水-辛酸法脂肪残留*7.9注：脂类残留(mg/mL 卵黄原液)=IgY 提取液中脂类浓度(mg/mL)IgY 提取液体积。表 2 不同去脂方法的 IgY 提取率比较指标测定8-9脂肪测定：氯仿-甲醇法；蛋白质含量测定： Bradford 法；IgY 含量测定：单向琼脂扩散法；效价 测定：双向琼脂扩散法；活性及纯度：免疫电泳法。2结果与讨论2.1琼扩结果图1.5去脂方法氯仿法 辛酸法 水稀释法 水-辛酸法提取率(%)82.759.194.393.4注：IgY 提取率（%）提取后浓度（mg/mL）提取前浓度（mg/mL）。由表 1 中可以看出，水稀释法的去脂效果最差， 辛酸法效果优于水稀释法。实验中发现水稀释法处理 卵黄后上清液表层漂浮有油层，可能是一些脂肪酸， 所以考虑采用另一方法即水-辛酸法，具体操作为： 向水稀释法制得 IgY 分离液中加入 1%辛酸，搅拌10min（利于脂肪酸的萃取），立即冷冻 10min，待辛 酸凝固后，立即快速抽滤，除去辛酸和脂肪酸。结果 表明，两种方法结合起来去脂效果提高了许多。接着 再通过硫酸铵沉淀法来提取 IgY，效果比较如表 2 所示，可以看出水稀释法的提取率最好，同样水-辛酸 法结合硫酸铵沉淀( 水-辛酸-硫酸铵法)的提取率也 非常高，究其原因是，辛酸可选择性地沉淀血清白 蛋白( 活性蛋白)、 s-糖蛋白( 活性蛋白)和抗生物素蛋白，而硫酸铵则可选择性地沉淀 IgY( 活性蛋 白)，两种试剂若相互配合，可明显提高 IgY 的提取 率。综合考虑去脂效果和提取率等各种因素，认为阳性血清图 1 IgY 与标准血清对照图 2 IgY 琼扩结果如图 1、图 2 所示。中间孔点抗原，图 1 为免疫后第 15d 的卵黄琼扩结果，其中最上孔点标准阳性 血清作对照，其余孔点不同稀释度的卵黄稀释液（顺时针分别为：11、12、14、18、116）。图2 为第 60d 的卵黄琼扩结果，逆时针为 141128 稀释度的卵黄稀释液，所形成的实线即为免疫沉淀 线。由图 2 可以看出通过实验的免疫程序免疫后，卵黄中抗体效价最少可达到 107，满足预期效果。2.2 免疫结果1 次饮水免疫，3 次肌注免疫，分别是第 0、10、20d 和 38d，第 38 d 免疫是根据效价的变化而定的， 见图 3。由图 3 可看出第 35d 和 63d 出现效价高峰。然后再收集 63d 以后的鸡蛋进行 IgY 的分离提取。水 辛酸 硫酸铵法在实验的4 种方法中是提取 IgY 的-最好方法。2.4IgY 的质量及性质鉴定对通过水-辛酸-硫酸铵法工艺得到的 IgY 干粉 进行分析，产率为 4.67mg/mL 卵黄原液，测得其平 均效价为 96，单位效价为 20.56 个效价单位/mg 蛋 白质，纯度约为 85%IgY 纯度(%)=IgY 浓度(mg/mL)总蛋白浓度(mg/mL)。对其再进行免疫电泳，定 性上分析 IgY 的性质，电泳结果见图 4 所示。1401201008060402000 10 20 30 40 50 60 70 80天数(d)图 3 免疫效价曲线2.3IgY 提取方法的确定鸡卵黄免疫球蛋白分离提取的实质是从脂溶性 蛋白和水溶性蛋白的混合体系中分离纯化出水溶性免疫球蛋白。如何去除高浓度的脂类对于 IgY 的分图 4 IgY 提取液的免疫电泳如图 4 所示，上孔加入 IgY 电泳纯标准溶液作 对照，下孔加入 1.3mg/mL 浓度的 IgY 提取溶液，电 泳后向中间细槽加入适量兔抗鸡 IgG 抗血清，37100No. 5. 2003效价营养研究下进行免疫扩散。由结果可发现，虽然在 pH8.6、IgY带负电荷情况下电泳，IgY 的泳动结果却偏向负极， 究其原因，IgY 分子量较大，电泳时同时受到电场 力和电渗力(由正极向负极)的作用，由于电泳速度 小于电渗速度，所以整个分子会偏向负极。另外， 电泳后还存在一条微弱的沉淀线(图 4 下孔)，这说明 了 IgY 分子具有不均一性，因为首先能形成沉淀线 表明不是杂蛋白，再者通过免疫原免疫所得的抗体 是一种多克隆抗体，也就是说是多种结构略有差异 的抗体组分混合物，所以会出现不止一条沉淀线的结 果。这也进而能说明不同的抗原免疫得到的 IgY 抗 体，其分子量和等电点等会有所差异，只能用一个范 围来说明。通过 Fe3金属螯合亲和柱层析法可以分离 出 IgY 抗体分子的不同亚类，可以充分说明其分子的 不均一性。最后，通过水-辛酸-硫酸铵法提取 IgY， 其纯度还不高，但是如果提取的目的是用来进行防治 某种疾病的话，这种纯度已能够达到要求了，相反纯 度很高时防治效果却不好；如果要用作免疫检测试 剂，则还需要再通过其他方法来进一步提纯，比如离 子交换色谱法、亲和色谱法、嗜硫性色谱法等。3结论3.1卵黄免疫球蛋白的最佳提取方法为水-辛酸-硫 酸铵法：卵黄与水的稀释比为 19，pH 为 5.3，辛 酸添加终浓度为 1%，硫酸铵沉淀采用 2 次沉淀即50%饱和度和 33%饱和度。3.2水-辛酸-硫酸铵法提取的 IgY，如果要作为免疫检测试剂，还需再用其他方法进一步纯化。3.3卵黄免疫球蛋白 IgY 分子具有不均一性。参考文献：Sturmer AM, Driscoll DP, et al. A Quantitative immunoassay using chicken antibodies for detection of native and recombinant alpha-amidating enzyme. J Immunol Methods, 1992,146(1):105罗函禄.高免卵黄抗体的应用及其展望.江苏农业科学，1997，(5)：62Ken T, Hirom I. Specific chicken egg antibody and method for its production. European Patent Aplication, EP 0503291 A1Akita E M.Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic Ecoli strain.J Immunol Methods,1993,160:207Lee Young-zoon. Large-scale purification of egg immunoglobulin. US Patents:5367054, 1994康亦兼.水稀释法分离卵黄 IgY. 吉林大学自然科学学报，2001，(3)：84路等学,王秉峰, 等.抗 ND、AC、PA 血清抗体与抗 ND 卵黄抗体提纯.甘肃科学学报，2000，(3)：61 宋宏新,李敏康.现代生物化学实验技术教程.陕西：陕 西人民出版社，200212345678（上接第 98 页）饲料工业, 2000, (7):42-44陈正行, 周彤. 米糠一种潜在的健康食品优质原料J. 粮食与饲料工业, 1999, (10):40-43孙军, 曹忠. 米糠的微波热处理稳定化J. 食品科 技, 2001,(4):4-5姜燕. 米糠化学成分研究概况J. 国外医药植物 药分册, 1992, 7(5):205-209戚奋. 米糠的医药用途J. 粮食与饲料工业, 1994, (8):16-18陈睿, 宋光泉. 米糠的综合利用J. 粮食与饲料工业, 1999, (2):33-36赵国华, 等. 米糖保健功能因子J. 粮食与油脂,1999, (2):39-41王立, 李柱, 陈正行. 米糠稳定化研究J. 粮食与油 脂, 2002, (9):37-38李金平. 应用数理统计M. 开封：河南大学出