宏基因组测序在临床中的应用mNGS

宏基因组测序mNGS在临床中的应用2022年3月1日mNGS基本概念1mNGS临床病原菌检测背景2mNGS在临床上的应用3报告解读4目录CONTENTS第一节mNGS基本概念宏基因组宏基因组（Metagenome）:广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和。狭义宏基因组是指特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和。宏基因组测序mNGSNGS：也称高通量测序，是一种可以同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。mNGS：m指宏基因组，也称元基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。mNGS指宏基因组二代测序，以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，利用高通量测序平台进行基因组DNA和RNA测序，分析所有微生物组成、种类和活性等。宏基因组测序检测范围宏基因组检测原理mNGS是利用宏基因组学原理，提取感染部位样本中的核酸，采用常规文库构建流程，利用二代高通量测序平台进行核酸测序，与微生物专用数据库进行比对分析，获得疑似致病微生物的种属信息，并提供全面深入的报告参数。样本采集：根据不同采样方法收集感染部位的样本核酸提取：利用试剂盒对采集的样本进行核酸提取高通量测序：构建好常规文库后，利用高通量测序平台进行测序生物信息分析：下机数据经过预处理质检合格后，与微生物专用数据库进行比对分析出具检测结果：获得疑似致病微生物的种属信息mNGS检测步骤传统方法VS宏基因组目前可培养的微生物极少未培养细菌达93.5%未培养古菌达98.3%传统病原检测方法宏基因组检测方法细菌/真菌以培养为主，阳性率仅有15-20%，需要3-5天报告时间无偏性病原体广覆盖（细菌、真菌、病毒、寄生虫），灵敏度高病毒以PCR检测与血清检测为主，检测目标狭窄，靶标固定深入提供病原鉴定，分型难以检测新发/罕见病原，难以检测疑难混合感染以序列为基础，可检测新发病原体，并进行溯源分类诊断方法阳性率耗时通量收费涂片镜检＜10%1小时1种微生物15细菌培养后质谱鉴定＜10%3-14天几十种微生物＞240抗原抗体检测＜10%3-5天1种微生物20-60PCR检测10%-30%2小时-3天1种微生物60-80多重PCR检测10%-30%2小时-5天6-33种微生物1000-2400mNGS50%-80%1-3天1万-2万种微生物4000-6000其他检测方法VS宏基因组靶标单一经验猜测培养率低钓鱼式传统检测VS全面覆盖无需预设无需培养一网打尽mNGS是不是？是什么？传统方法VS宏基因组第二节mNGS临床病原菌检测背景感染性疾病威胁人类健康WHO全球每年约有1500万人死于感染，占全球总死亡人数25%中国中枢神经系统感染脓毒血症下呼吸道感染发病人数＞500万/年患者人数＞568万/年发病人数＞1000万/年死亡率17-70%死亡率28-50%死亡率30%50-60%病因不明40-50%病因不明15-62%病因不明病因不明导致抗生素滥用病原微生物（病原体）是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，其中以细菌和病毒的危害性最大。近年来，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物感染已成为全球关注的焦点。全球每年约70万人死于抗生素耐药中国住院患者使用抗生素比例约80%-90%儿童发生感染性疾病居多，也是应用抗菌药物最多的群体。我国儿科抗菌药物使用与国外比较：1.抗菌药物使用强度高2.用药种类多3.药物抗菌谱广4.注射用药比例高5.新型、昂贵、光谱的第三代头孢菌素、β-内酰胺类/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂类药物使用逐年增加。技术背景样本培养聚合酶链式反应血清抗原检测耗时长操作复杂检测单一阳性率低存在不可培养病原体传统检测方法病原检测范围广标本检测类型多可检测混合感染可检测罕见特殊感染可检测低浓度感染病原技术背景病原学诊断是感染性疾病诊治中的重要环节，传统的病原学诊断是临床医师根据患者临床表现做出鉴别诊断，并进行针对性检测，通常一项检测只能对应一种病原体；宏基因组学第二代测序技术（metagenomicsnextgenerationsequencing，mNGS；以下简称二代测序）因其覆盖度广、时效性强等特点越来越多地被应用于临床感染性疾病的精准诊断。第三节mNGS在临床上的应用mNGS在感染性疾病领域中的实际应用1)病情危重需要尽快明确病原体；2)特殊病人如免疫抑制宿主，合并基础疾病，反复住院的重症感染患者需要尽快明确病原体；3)传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳；4)疑似新发病原体，临床上提示可能有一定的传染性；5)疑似特殊病原体感染；6)长期发热和／或伴有其他临床症状，病因不明的感染。mNGS在感染性疾病领域中的研究进展-里程碑论文

[影响因子]70.67[发表时间]2014.062014年，一名患有严重联合免疫缺陷的14岁男童在4个月的时间里三次到医疗机构就诊，发烧和头痛发展为脑积水和癫痫持续状态，导致昏迷。通过多种抗菌药物仍然无法改善脑积水和癫痫状态，脑活检在内的诊断无法找到病因。研究者通过脑脊液（CSF）宏基因组测序检出圣地罗西钩端螺旋体序列，随后通过更换使用青霉素进行治疗，男童32天后痊愈出院。NGS检测病原体：钩端螺旋体，占比0.016%；验证：靶向PCR和Sanger测序治疗调整：改用青霉素G治疗，32天出院mNGS在感染性疾病领域中的研究进展

[影响因子]16.494[发表时间]2017.07选取22名因急性呼吸道疾病而住院的造血细胞移植患者，进行支气管镜检和支气管肺泡灌洗，对灌洗样品进行微生物分析。利用临床诊断标准方法在7个患者的支气管肺泡灌洗样品中检测出微生物，其中6个患者的微生物被认为是病原体，这些微生物均可利用宏基因组下一代测序方法（mNGS）检测到。mNGS可检测出人冠状病毒（HCOV）229E及人轮状病毒A（HRV-A），这些病毒是社区获得性肺炎的主要诱因，临床诊断标准方法无法检测出。[影响因子]9.055[发表时间]2018.11研究纳入了2511份标本（包括传染病、非传染病和未确诊病例），在宏基因组测序和传统培养方法之间比较诊断性能宏基因组测序诊断传染病的敏感性和特异性分别是50.7%和85.7%，都显著优于传统培养方法，特别是病原为结核分枝杆菌、病毒、厌氧菌和真菌的感染；重要的是，传统方法无法确定病原的可由宏基因组测序确定，有43例因此改变了诊断结果；为了实现该方法分别构造了病毒、细菌、真菌和寄生虫的参考序列数据库。mNGS在感染性疾病领域中的研究进展

新型冠状病毒的鉴定使用mNGS方法从支气管肺泡灌洗液（BALF）中提取RNA。迅速鉴定出一种新的冠状病毒（根据世界卫生组织的公告命名为2019nCoV），它是样本中唯一的高丰度病原体（占总RNA序列的1.5%和0.62%）基于RNA的mNGS方法快速鉴定和鉴定一种潜在的病原体，这对疾病控制和预防具有重要意义。基于宏基因组新一代测序技术(mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观的检测临床样本中的较多病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），且无需特异性扩增，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。国内首篇mNGS检测应用专家共识mNGS相关共识/指南2021年国家卫健委最新发布指导意见进一步明确：基因测序技术被列入常用病原学检测方法范围。该技术具有速度快、通量高、敏感性高、病原覆盖范围广等优势。在罕见、未知病原体鉴定方面发挥着重要作用。关于mNGS卫健委发文检测样本要求第四节mNGS检测结果解读mNGS检测结果解读1）解读报告考虑如下参数：测序质量（是否去除低复杂度、低质量序列，Q20、Q30等）、读长、特异性读长、覆盖率、深度、丰度、微生物序列的数据量、阈值等2）mNGS检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病毒、流感病毒，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。3）血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症mNGS检测结果解读4）mNGS报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值。5）建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的PCR或一代测序等分子生物学检测，G试验，GM试验，曲霉菌IgG抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验。6）采用mNGS进行病原微生物鉴定的同时，可以考虑检测耐药基因，但需要将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值。即通过对mNGS测得序列进行具体病原体基因组组装之后，确定耐药基因位于哪个病原体上，位于质粒上还是位于染色体上mNGS检测结果解读

7）mNGS对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系。8）mNGS结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑mNGS检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于PCR等常规检测方案9）建立mNGS病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值，建议各实验室建立自已的阈值，并在临床工作中加以验证。mNGS检测结果解读10）不同病原微生物读长对结果判断的影响：同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫>真