蛋白质结构与功能PPT课件

-,1,第一节蛋白质的化学组成,第二节蛋白质的分子结构,第三节蛋白质结构与功能的关系,第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化,第二章蛋白质结构与功能,-,2,蛋白质的主要生理功能,蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：,催化功能；结构功能；调节功能；防御功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能,-,3,碳(C)50%55%,氢(H)6%8%,氧(O)19%24%,氮(N)13%19%,16%；N(g)6.25=样品Pr含量,硫(S)0%4%,少量的磷(P)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)和碘(I)等,第一节蛋白质(protein)的化学组成,元素组成,-,4,生物体内的氨基酸类别,蛋白质氨基酸：蛋白质中常见的20种氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸等。非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨基酸。,-,5,或,构成蛋白质的20种氨基酸(aa)的结构特点:,1.均为L氨基酸，各种aa的R侧链各不相同,2.碳原子上均连有一个氨基(脯氨酸除外),3.-碳原子为不对称(手性)碳原子(甘氨酸除外）,一氨基酸(aminoacid)蛋白质的基本构成,氨基酸结构通式,-,6,（一）氨基酸的分类,根据氨基酸侧链基团()的结构和理化性质，将其分为：,1.非极性氨基酸,2.极性氨基酸,酸性氨基酸,碱性氨基酸,中性氨基酸,-,7,1.非极性氨基酸,包括7个：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）和脯氨酸（Pro）,-,8,2.极性氨基酸,R-基含有极性基团；中性,酪氨酸(Tyr),生理pH条件下不解离。,色氨酸(Trp)、,丝氨酸(Ser)、,半胱氨酸(Cys)、,蛋氨酸(Met)、,天冬酰胺(Asn)、,谷氨酰胺(Gln)、,苏氨酸(Thr)、,包括8个：,-,9,-,10,3.酸性氨基酸,R-基有COOH(COO-),带负电荷,-,11,4.碱性氨基酸,R-基有NH2(NH3+),赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His),带正电荷,-,12,精氨酸（Arg）,组氨酸（His）,胍基,咪唑基,-,13,1.两性解离及等电点,（二）氨基酸的理化性质,pHpI,pH=pI,-,14,等电点(pI)：,氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，,分子所带的净电荷为零，此时溶液的pH值就称为该氨基酸的等电点。,除碱性氨基酸外，其余氨基酸的等电点均小于pH7,pI=1/2（pK1+pK2）,若一个aa有3个解离基因，则其pI为兼性离子两边pK的平均值,-,15,2.紫外吸收性质,色氨酸和酪氨酸在280nm波长附近对紫外光有最大吸收峰。,据此可以通过测定蛋白质溶液280nm的吸光值快速测定其蛋白质含量。,3.茚三酮反应,aa与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化合物，在570nm处有最大吸收。据此亦可用作aa含量分析。,-,16,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max257nm，257=2.0 x102;色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,-,17,氨基酸与茚三酮反应,+,水合茚三酮(无色),紫色化合物,水合茚三酮,-,18,氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）,PITC（phenylisothiocyanate）,+,苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）,-,19,氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应）,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,DNP-AA(黄色),+,+HF,氨基酸,-,20,（一）肽与肽键,脱去一分子水缩合形成的键,二、肽,一个氨基酸的-羧基与,另一个氨基酸的-氨基,肽键的概念：,称肽键(peptidebond),-,21,肽,氨基酸借肽键相连而形成的化合物称肽(peptide),寡肽(oligopeptide),由10个以内氨基酸连成的小肽,多肽(polypeptide),由许多氨基酸连成的肽,又称多肽链或肽链,其形状为一条没有分支的长链，,氨基末端(端),羧基末端(C端),-,22,+,丙氨酸,苯丙氨酸,肽键,二肽,苯丙氨丙氨酸,-,23,肽和肽键的形成,肽单位,肽键,-,24,在肽键中，与相连的氧原子和氢原子呈反式构型,（反式）,（顺式）,肽键的特点：,-,25,肽键的特点：,CN单键为0.149nm,C=N双键为0.127nm,具有部分双键性质,不能自由旋转,肽键中键长为0.132nm,-,26,氨基酸在形成肽链时丢失了一分子水，肽链中的氨基酸分子已不完整，,氨基酸残基,称为氨基酸残基(aminoacidresidue)。,蛋白质与多肽的区别：,Protein,空间构象相对稳定,氨基酸残基数较多,Peptide,空间构象不稳定,氨基酸残基数较少,-,27,（二）生物活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione，GSH),构成第一个肽键的羧基是谷氨酸的羧基,由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)组成的三肽,(1)组成,(2)功能,GSH是体内重要的还原剂,-,28,谷胱甘肽,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,-,29,由下丘脑分泌，其功能是促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢)。,2.促甲状腺素释放激素,(1)组成,(2)功能,-,30,三、蛋白质的分类,1.根据组成成分分为：,单纯蛋白质全部由aa组成；,结合蛋白质除蛋白部分外，还含非蛋白部分。,结合蛋白质中的非蛋白部分称为辅基，常以共价键与蛋白部分相连。,辅基：包括色素、寡糖、脂类、磷酸、金属离子、核酸等,-,31,2.根据其形状分为：,纤维蛋白质分子状如纤维，其长轴比纵轴大于10：1,球状蛋白质分子状如球形或椭圆形,常难溶于水，常作为细胞支架和细胞连接，如大量存在于结缔组织中,常可溶于水，如酶、转运蛋白、免疫球蛋白等,-,32,第二节蛋白质的分子结构,一、蛋白质的一级结构,二、蛋白质的二级结构,三、蛋白质的三级结构,四、蛋白质的四级结构,高级结构或空间结构,-,33,蛋白质结构的主要层次,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primarystructure,secondarystructure,Tertiarystructure,quariernarystructure,-,34,一、蛋白质的一级结构,蛋白质一级结构的概念：蛋白质分子中所有氨基酸的排列顺序，称一级结构中的主要化学键：肽键，二硫键氨基酸序列书写：以氨基末端开始羧基末端结束，依次编1、2、3,-,35,蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序称为蛋白质的一级结构,-,36,胰岛素的一级结构,各种蛋白质的根本差异在于一级结构的不同,-,37,一级结构测定,基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法要点：a.测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分b.测定肽键的N末端和C末端c.应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。d.分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序e.将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。,-,38,蛋白质顺序测定基本战略,-,39,二、蛋白质二级结构,概念：是指蛋白质分子中一段多肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及到aa侧链R基团的构象。肽单元（肽平面）：肽键的6个原子C1、C、N、O、H、C2位于同一平面，构成所谓的肽单元,-,40,肽单位,-,41,肽键中的和均不能自由旋转,肽键(-CONH-)中的个原子,个碳原子(C),和,被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽单元(peptideunit)。,-,42,酰胺平面与-碳原子的二面角（和）,二面角两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。,-,43,完全伸展的多肽主链构象,-碳原子,酰胺平面,=1800，=1800,=00，=00的多肽主链构象,酰胺平面,=00，=00,侧链,非键合原子接触半径,-,44,蛋白质的二级结构类型,螺旋结构,折叠结构,-转角,无规卷曲,-,45,（一）螺旋(helix),由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象,1.概念,-,46,2.螺旋的结构特征,(1)以肽键平面为单位,以碳原子为转折盘旋形成右手螺旋,-,47,(2)每3.6个氨基酸残基绕成一个螺圈(3600),螺距为0.54nm,每个氨基酸上升0.15nm,肽键平面与中心轴平行,-,48,(3)主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部,-,49,(4)肽键的CO和NH都形成氢键,是稳定螺旋的主要作用力,氢键的方向与中心轴大致平行,-,50,（二）折叠(pleatedsheet),故又称折叠片或片层。,肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称折叠。,常为两条或两条以上伸展的多肽链,侧向聚集在一起形成扇面状，,1.概念,-,51,2.折叠结构特点,()相邻肽键平面的夹角为1100，呈锯齿状排列；,侧链基团交错地分布在片层平面的两侧。,-,52,()由氢键维持稳定。其方向与折叠的长轴接近垂直。,()条肽段平行排列构成，肽段之间可顺向平行(均从N-C)，也可反向平行。,-,53,（三）转角(turn),肽链出现1800回折的转角处结构称为转角。,1.概念,2.结构特征,*第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键.,*常见于球状蛋白质分子表面.,-,54,（四）无规卷曲(randomcoil),1.概念,没有确定规律性的肽键构象,常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起调节作用，有利于整条肽链盘曲折叠,-,55,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,无规则卷曲示意图,-,56,(五)蛋白质的超二级结构和结构域,(2)结构域（structuredomain）,蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或折叠或转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式：；,在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。形成意义：动力学上更为合理蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性,()超二级结构（supersecondarystructure）,-,57,超二级结构类型,12345,52341,-链,-迂回,回形拓扑结构,回形拓扑结构,-迂回,-,58,三蛋白质的三级结构,称为蛋白质的三级结构(trertiarystructure),1.概念,一条多肽链中所有原子在三维空间的整体排布包含了主链构象和侧链构象的内容,-,59,结构域(structuraldomain),一条肽链通过盘曲折叠,常形成2个或多个在空间上可以明显区分的折叠实体，称为结构域.,*类型,*概念,全a-螺旋、,a/,全-折叠、,无规则卷曲,-,60,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,结构域2,-,61,噬菌体T4全a-螺旋结构域,磷酸丙糖同分异构酶a/结构域,-,62,由这些结构域缔合成具有三级结构的分子或亚基,蛋白质三级结构的意义：,蛋白质的三级结构决定了蛋白质的生物学功能.,-,63,疏水核：疏水区从位于分子内部，往往是与辅酶/基或底物结合位点。,维持蛋白质三级结构稳定的因素,亲水区：亲水区多位于分子表面，故球形蛋白质水溶性较好。,-,64,维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键b.氢键c.疏水键d.范得华力e.二硫键,多肽链,-,65,维系蛋白质结构的作用力,1.肽键,共价键,2.二硫键,共价键,3.次级键,非共价键,维系蛋白质空间结构,维系蛋白质一级结构,维系蛋白质三级结构,次级键的种类：,氢键、疏水相互作用、离子键和范德华力,-,66,氢键,负电性很强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢键。,-,67,疏水相互作用,由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力,疏水作用示意图,-,68,离子键,由异性电荷间的静电吸引形成的键。,-,69,四蛋白质的四级结构(quaternarystructure),是指亚基间的空间排布、亚基间相互作用与接触部位的布局，不包括亚基本身的空间结构。亚基间以次级键相连，绝无共价键。,1.概念,-,70,-,71,蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级结构，分子中的每一个具有独立三级结构肽链,称为亚基,亚基(subunit),2.维持蛋白质四级结构的作用力,主要是疏水作用,次级键,盐键、氢键,-,72,第三节蛋白质结构与功能的关系,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构与功能的关系,以124个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶（4对二硫键）为例说明,-,73,牛胰核糖核酸酶的变性与复性,-巯基乙醇,尿素或盐酸胍,透析,有活性,无活性,-,74,1.一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构不同的蛋白质功能不同,胰岛素的一级结构及种属差异,（二）一级结构与功能的关系,-,75,ACTH促肾上腺素皮质激素,MSH促黑激素,一级结构不同的蛋白质功能不同,-,76,HbS与HbA的区别,-亚基第6位氨基酸,正常人：Glu,患者：Val,-,77,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,镰刀形红细胞,正常红细胞,-链N端氨基酸排列顺序12345678Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-LysHb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,-,78,-,79,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物与人不同的AA数目黑猩猩0恒河猴1兔9袋鼠10牛、猪、羊、狗11马12鸡、火鸡13响尾蛇14海龟15金枪鱼21角饺23小蝇25蛾31小麦35粗早链孢霉43酵母44,-,80,不同生物来源的细胞色素c中不变的AA残基,35个不变的AA残基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与“识别”并结合细胞色素还原酶和氧化酶。,-,81,例2,由4个亚基组成,血红蛋白,功能:运输O2,-,82,二、蛋白质空间结构与功能的关系,（一）肌红蛋白（Mb）与血红蛋白结构（Hb）,蛋白质的空间结构决定生物学功能,肌红蛋白（1个亚基）与血红蛋白（4个亚基）且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力。,其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合,-,83,-,84,O2,-,85,血红蛋白输氧功能和构象变化,-,86,O2,（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力,-,87,变构效应,蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化,其功能也随之变化的现象,称为变构效应,协同效应,蛋白质分子中的1个亚基与其的配体结合后,能影响其它亚基与配体的结合,称为协同效应,促进,正协同效应,抑制,负协同效应,-,88,血红蛋白与氧结合的正协同效应,氧饱和度,静脉血,动脉血,氧分压,P50,100%-,Hb,Mb,-,89,第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化,一、蛋白质的理化性质,（一）两性解离和等电点,-,90,蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值。,+OH-,+H+,+OH-,+H+,pH=pI,pHpI,此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。,等电点（pI）：在某一pH值溶液中，,蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当,蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零,-,91,蛋白质分子颗粒大小1100nm之间,属胶体颗粒范围，,蛋白质的胶体原因：,表面形成水化层,表面同种电荷的斥力,（二）蛋白质的胶体性质,在溶液中能形成稳定的胶体,-,92,（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固,1.蛋白质的变性作用,在某些理化因素作用下，,蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的变性作用(denaturation)。变性后的蛋白称为变性蛋白质。,概念:,-,93,常见的变性因素：,强酸、,强碱、,有机溶剂、,尿素、,胍、,重金属,生物碱、,化学因素,物理因素,剧烈振荡,热、,紫外线、,超声波、,-,94,变性蛋白质的主要特征:,一级结构不变。,（2）生物活性丧失。,粘度增加而扩散系数减小。,（4）变性蛋白质容易消化。,（1）蛋白质分子中的次级键断裂，,（3）变性蛋白质的溶解度常降低、,构象破坏，但不涉及共价键的破坏，,-,95,除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性,蛋白质的复性(renaturation),-,96,核糖核酸酶变性与复性作用,Nativeribonuclease,Denativereducedribonuclease,Nativeribonuclease,变性,复性,-,97,当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。,2.蛋白质的沉淀(pre-cipitation),概念:,应用:,(1)蛋白质分离纯化,(2)解毒,(3)临床检验,-,98,(1)盐析法(saltingout),向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析,常用的中性盐：,不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。,硫酸铵、,硫酸钠、,氯化钠等,使蛋白质沉淀的方法,概念：,特点：,作用原理:,盐离子与水亲和力极强，,夺去蛋白质的水化层，减少分子间静电斥力,-,99,(2)有机溶剂沉淀法,使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。,必须在低温下操作,注意事项:,尽量缩短处理的时间,及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去,甲醇、乙醇、丙酮,缺点：,原理:,常用有机溶剂:,常会使蛋白质变性,-,100,重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。,(3)重金属盐沉淀法,此法常使蛋白质变性失活。,若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生,缺点：,原理:,-,101,生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。,(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法,反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子形式存在,缺点：,原理:,常引起蛋白质变性,注意事项:,-,102,3.蛋白质的凝固作用,蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果。,如加热可使蛋白质变为不再溶解的凝块。,-,103,(四)蛋白质主要呈色反应,双缩脲反应酚试剂反应蛋白质定量、定性茚三酮反应测定常用方法,-,104,双缩脲反应,蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物,红紫色络合物,(硷性溶液),Cu2+,-,105,2.米伦氏反应酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成色氨酸的反应（吲哚环的反应）鉴定蛋白质中是否含有色氨酸明胶中不含色氨酸4.坂口反应精氨酸的反应（胍基的反应）精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物鉴定蛋白质中是否含有精氨酸定量测定精氨酸,-,106,5.福林试剂反应酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）福林试剂：磷钼酸-磷钨酸与双缩脲法结合-Lowry法在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物灵敏度提高100倍6.茚三酮反应灵敏度差7.黄蛋白反应浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应生成黄色化合物指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝G-250本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色与蛋白的亲和力强，灵敏度高1-1000微克/毫升,-,107,（五）蛋白质的紫外吸收光谱,蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,测定范围：0.10.5mg/ml,-,108,二、蛋白质的分离纯化,(一)盐析和有机溶剂沉淀,(二)电泳,(三)透析和超滤,(四)层析,(五)超速离心,-,109,分类：根据支持物的不同，电泳电泳可分为：薄膜电泳、凝胶电泳。,（二）电泳,概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方向移动称为电泳。,原理：不同的蛋白质的因结构、形状和带电量的不同而有不同的泳动速度，从而达到分析和分离蛋白质的目的。,应用：电泳技术是生化常用分析技术之一,-,110,利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤。,将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化，这种方法称为透析。,（三）透析,-,111,透析工作图,半透膜原理,-,112,层析种类：凝胶过滤（分子筛）离子交换层析（阴离子和阳离子）亲和层析,(四)层析,-,113,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,-,114,分子筛层析,-,115,（五）,-,116,亲和层析工作示意图,蛋白质,载体介质,配体,结合,洗脱,洗脱介质,-,117,(六)超速离心,-,118,三、多肽链中氨基酸的顺序分析,第一步：分离提纯蛋白质，测定NH2末端的数目，确定蛋白质分子是由几条肽链构成的，并分离出每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成该肽链的氨基酸残基数。及每种aa的百分组成。,一般过程：,肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量120（各种的氨基酸残基的平均分子量为120）,再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨基酸分离。,-,119,a.丹磺酰氯法丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链N-端-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。,第二步测定肽链的氨基末端和羧基末端,1.N末端的测定,b.二硝基苯氟法：过时，不用,-,120,2.C末端的测定,常用羧基肽酶法,羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，分别进行顺序分析。,-,121,第三步肽链的局部水解,胰蛋白酶的作用原理,1.酶解法,-,122,CNBr与Met反应测定Pr的一级结构,2.化学法,-,123,层析鉴定就可N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序,第四步肽段氨基酸顺序分析,一般采用Edman降解法,弱碱条件,异硫氰酸苯酯,+,N端-氨基,苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）,酸性条件,环化,水解,苯乙内酰硫氨基酸(PTH-aa),失去原N-端氨基酸的肽,剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-aa，,-,124,Edman降解法的示意图,-,125,一般常用多种方法使肽链断裂，并