菌种的管理和保藏PPT课件

2020/5/2,1,.,菌种的保藏和管理,杜平华,2020/5/2,.,2,菌种保藏的重要性,菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结果的正确性。,2020/5/2,.,3,菌种的来源,国内或国外认可的菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。,2020/5/2,.,4,-广泛收集各种有用的微生物菌种。-选择最适宜的保藏方法。,菌种保藏的中心任务,2020/5/2,.,5,常用菌种保藏方法,菌种保藏的原则根据微生物菌种的生理、生化特性降低微生物细胞的代谢强度。,2020/5/2,.,6,标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按验证的方法进行。标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构获得的标准菌株经复活并在适宜的培养基中生长后,既为标准储备菌株。,菌种的保藏,2020/5/2,.,7,菌种的保藏,抑制微生物的代谢和生长繁殖，如低温、干燥和真空等标准储备菌株经纯度和特性确认后，分装于小瓶中,可采用低温冷冻干燥，液氮储存，超低温冷冻(低于-70)等方法保存。,2020/5/2,.,8,菌种的保藏,低于-70或低温冷冻干燥可以延长菌种的保存时间.标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。,2020/5/2,.,9,菌种的保藏,工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。,2020/5/2,.,10,菌种的保藏,不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：,2020/5/2,.,11,挑选特征典型的纯菌菌落。确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽孢死亡代谢作用弱，同时对恶劣环境有很强的抵抗力。选择最适宜的方法。定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保藏方法的有效性。,菌种的保藏,2020/5/2,.,12,菌种的保藏,2020/5/2,.,13,琼脂斜面低温保藏法,2020/5/2,.,14,液体冷冻保藏法,2020/5/2,.,15,液体冷冻保藏法,制备方法1%蛋白胨1.5ml加入甘油0.15ml,接种新鲜培养物,培养.保存条件-80可保存数年.,2020/5/2,.,16,瓷珠菌种保存,使用方法-用接种环挑取18-24小时新鲜培养物接入冻存液中-拧紧瓶盖，来回颠倒制成均匀的菌悬液-使菌悬液充分吸附在小瓷珠内外表面-将冻存管中的菌悬液吸出-使用时充分摇匀使管内瓷珠分散,取出小瓷珠，可以直接在平板培养基上划线接种或接种液体培养基,培养。保存条件室温保存12个月、-20保存12个月、-80可保存24个月,2020/5/2,.,17,二、菌种的传代和使用,工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止过度的传代造成菌种变异。,2020/5/2,.,18,细菌的接种、分离和培养接种：将微生物的培养物、含有微生物或可能污染有微生物的样品接种到培养基上的一种操作技术。,2020/5/2,.,19,常用培养基种类,斜面培养基半固体斜面培养基液体斜面培养基平板斜面培养基,2020/5/2,.,20,接种方法涂布法划线法穿刺法直接加入法等,2020/5/2,.,21,分离：为了获得纯菌种（株），采用的将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁殖形成单个菌落的操技术。分离一般采用平板培养基。分离方法主要有分段划线法、连续划线法、涂布分离法、倾注分离法等。,2020/5/2,.,22,接种后的培养基，根据不同微生物生长条件的要求，培养基放在适宜微生物生长的环境中温度、湿度、氧气等），使其生长繁殖的过程。需气菌培养法厌氧培养法,培养,2020/5/2,.,23,培养后微生物的生长判断固体培养基有菌落生长或沿穿刺线扩散生长。液体培养基浑浊、菌膜、沉淀等。,2020/5/2,.,24,菌种的传代和使用,冻干菌种（0代）增菌液培养（1代）增菌液培养（2代）分装冷冻保存增菌液培养适宜的斜面培养基使用工作菌株（3代）工作菌株传代（4代）冷冻保存工作菌株传代（5代）冷冻保存如使用蛋白胨、甘油水，可取各代的斜面培养物，加入培养基中，在规定条件培养后冷冻保存。,2020/5/2,.,25,斜面培养物稀释（比浊或预实验）菌液稀释平板计数验证实验、阳性对照平板计数也可和试验同时进行,菌液的制备和使用,2020/5/2,.,26,三、菌种的检查与复壮,菌种的衰退菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。控制菌种的衰退方法控制传代次数创造适宜的培养条件采用有效的保藏方法,2020/5/2,.,27,定期检查定期检查复活、分离、纯化、检查鉴定和再保藏。发现变异或衰退，应及时给予恢复。主要检查项目菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性及血清学检查。,菌种的检查与复壮,2020/5/2,.,28,菌种的复壮主要采用分离纯化的方法。经过形态特征、生理生化特征、代谢产物、血清学等一系列实验鉴定，证明复壮后的菌种与原种完全一致，方可认为菌种已被复壮。,菌种的检查与复壮,2020/5/2,.,29,四、菌种的管理,使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的条件和设备。菌种应由专人负责管理，管理人员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有较强的责任心。,2020/5/2,.,30,菌种的管理,实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理制度；包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及其它需要的程序。,2020/5/2,.,31,菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰箱，应上锁管理。由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并定期对保存的菌种进行检查，一般每年12次，（或定期更换冻干菌种）。发现菌种的异常情况应及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即报告、研究处理。尤其长期保存时。,菌种的管理,2020/5/2,.,32,详细记录菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴定等均应做好详细记录。包括菌保存位置、环境(温度)、种传代或使用时间、名称、菌号、代数、传代或保存形式、分离、复壮方式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。,2020/5/2,.,33,菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买应有证明和登记，并包装严密。菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应有详细记录。,2020/5/2,.,34,菌悬液的制备与保存,采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限度试验用菌悬液的制备如下：1、接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养1824小时.2、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10100cfu的菌悬液。,2020/5/2,.,35,3、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养57天。加入35ml含0.05（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05（