蛋白组学在肾脏病研究中的应用

蛋白组学在肾脏病研究中的应用,上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科王伟铭,前言,肾脏病的治疗进展缓慢细微的组织病理学：早期诊断、预后追踪以及疗效观察尿液：与泌尿系统之间存在着天然的联系，使得尿液在反映泌尿系统功能方面具有“地理”优势体外的肾活检,蛋白组学与肾脏,PubMed：关键词：proteomicsorproteomeorproteomictogetherwithkidneyorrenalorurineorurinary2010.11.1：过去5年1156篇解决临床及基础问题的途径,内容,蛋白组学技术蛋白组学与肾脏病研究,蛋白质组和蛋白质组学,蛋白质组（proteome）：细胞、组织或机体在特定的时间和环境中基因组所动态表达的蛋白质。蛋白质组学（Proteomics）：以蛋白质组为研究对象，在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体，并在此基础上对疾病发病机理、预后判断等方面进行探索从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域,Proteomicsincludesnotonlytheidentificationandquantificationofproteins,butalsothedeterminationoftheirlocalization,modifications,interactions,activities,and,ultimately,theirfunction.,NephrolDialTransplant(2010)25:1116,研究过程：蛋白质分离、鉴定以及信息资料分析处理三部分,蛋白质组学重要工具,1.蛋白质的分析分离技术。2D-SDS-PAGE：应用最为广泛1D-SDS-PAGE高效液相层析（HPLC）等电聚焦（IEF）毛细管电泳（CE）离子交换液相层析（LC）反向（RP）-HPLC串联。,Two-dimensionalGelElectrophoresis,CutoutSpotsandIdentifyProteinsbyTandomMassSpectroscopy,2.质谱（MS）技术：蛋白质肽的精确质量测定对肽序列进行分析,质谱技术,Massspectrometry-basedproteomictechnologies基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS):利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化电喷雾电离质谱(ESI-MS):在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化,表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（surfaceenhancedlaserdesorptionionizationtime-offlightmassspectrometry，SELDI-TOF-MS）通过测量肽段离子相关参数,如飞行时间(TOF),即可计算得到准确的肽段质量,质谱技术,FourdifferenttypesofMS-basedproteomictechnologies(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MS,FourdifferenttypesofMS-basedproteomictechnologies(a)2DE-MS;(b)SELDI-MS;(c)LC-MS;(d)CE-MS,不同蛋白质组学技术的比较,多维液相色谱-质谱技术,通过相对和绝对定量的同位素标签试剂（iTRAQ）,还可以用质谱进行蛋白质的定量分析。ICAT技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术(isotopecodedaffinitytags,ICAT)可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质质谱技术还可以用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等,新技术,AgilentHPLC-ChipII，是高通量、微型化和自动化为特点的蛋白组学检测技术。能同时从微量的样品中检测多种蛋白质或多肽，用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定。,数据分析datamining,蛋白质组研究中的生物信息学蛋白质氨基酸序列(sequence)数据库蛋白质结构域与家族数据库蛋白质高级结构及分类数据库蛋白质2DE图谱数据库蛋白质相互作用数据库,内容,蛋白组学技术蛋白组学与肾脏病研究,尿蛋白质组,Davis和Spahr（2001）：尿蛋白质组研究的早期开拓者用LC-MS/MS方法分析了酶切后的混合尿样，共鉴定出124个蛋白。Thongboonkerd（2002）：第一张人尿蛋白质组2D图67种蛋白及它们的异型体蛋白大部分是尿液中的高丰度蛋白由病变组织漏出、分泌、裂解而释放出的生物标志物很多都是低丰度蛋白,尿液标本的准备,标本收集:空腹晨尿或中段尿标本处理：蛋白测定乙醇沉淀ethanolprecipitation真空浓缩vacuumcentrifugation微浓缩microconcentration反相捕获柱reversephasetrappingcolumn标本储存：70或20,稳定性/差异性,尿蛋白质组在个体间存在着明显的差异由于锻炼、饮食、生理节奏等因素的影响，同一个体不同时间段的尿蛋白质组也会发生改变尿蛋白组随时间发生变化，晨尿较其他时间点包含更多蛋白点不同天内所得尿蛋白组间较同一天内不同时间点间差异更大,稳定性/差异性,个体间较个体内存在更明显的差异早期小样本试验得到的候选标志物必须经过大样本的验证，才能确定哪些蛋白的变化真正是由疾病导致的，而并非生物学上的变异造成的,糖尿病肾病,Belleietal.(2008)方法：2DE和ESI-Q-TOFMS/MS2型糖尿病早期肾脏改变：尿液生物标记物正常白蛋白尿(n=10)、2型糖尿病肾病(n=12)、健康对照(n=12).11种差异表达蛋白3种蛋白减少：前列腺酸性磷酸酶前体（prostaticacidphosphataseprecursor）,核酸核酶,激肽释放酶-38种蛋白进行性增加：transthyretinprecursor,免疫球蛋白(Ig)C链region,IgV链-IIregionCum,Ig-V链-IIIregionSIE,碳酸酐酶1,血浆视黄醇结合蛋白,2-微球蛋白前体,2-糖蛋白1.,ProteomicsClin.Appl.,2(4):478-491.,糖尿病肾病,Lapollaetal.(2009)方法：MALDI-MS病例：糖尿病、肾病、糖尿病肾病、健康对照差异蛋白：1219,1912,和2049DaMALDI-TOF/TOF：uromodulin,I型胶原1前体,和IV型胶原-5链前体,J.MassSpectrom.,44(3):419-425.,糖尿病肾病,WuJ,ChenYD,GuW（2008）方法：SELDI-TOF-MS病例：106例正常、微量、大量白蛋白尿DM、50例健康对照差异蛋白：4239.0,4453.5,5281.1,5898.5Da特异性：80%；敏感性：75%.,Wuetal./JZhejiangUniv-SciB(Biomed25:232241.,糖尿病肾病,Jiangetal.,2009b方法：2DE和MALDI-TOF-MS目的：监测糖尿病肾病的发生发展病例：12例DN(1型和2型糖尿病)、6健康对照差异蛋白：orosomucoid验证：90例糖尿病患者、30例健康对照尿orosomucoid排泄率(UOER)随白蛋白尿进行性上升尿orosomucoid可作为DN的生物标志物,NEPHROLOGY2009;14,332337,2-Dgelelectrophoresis(2-DE)imagesofurinesamplesfromdiabeticnephropathy(DN)patientsandhealthycontrols.,NEPHROLOGY2009;14,332337,IgA肾病,Haubitzetal.(2005)方法：CE-MS差异：正常对照（57例）IgAN特异性尿多肽谱IgAN（45例）：敏感性100%、特异性90%膜性肾病（13例）：敏感性77%、特异性100%3种多肽masses：2752.4,2427.1,2057.3Da血清白蛋白片段,KidneyInt.,67(6):2313-2320.,IgA肾病,Rocchettietal.(2008)方法：2DE和nano-HPLC-ESI-MS/MS病例：正常对照20例、IgANR(ACEI)9例、IgANNR9例差异蛋白:激肽原,inter-trypsininhibitorheavychainH4precursor(ITIH4),甲状腺素转运蛋白(transthyretin)验证：IgANR和IgANNR之间尿差异蛋白显著不同免疫杂交：低水平的尿激肽原提示IgAN对ACEI治疗反应差的预测指标,Proteomics,8(1):206-216.,肾小球肾炎,Mischak（2004-2005）方法：CE-MS-生物信息的方法构建一个尿液（和其他体液）蛋白质组诊断模型用于各种可以进展为肾衰的小球疾病的诊断和鉴别诊断。MCD(16)、MN(18)、FSGS(10)与正常尿液(57),KidneyInt,2004,65(6):2426-34KidneyInt,2005,67(6):2313-20MassSpectromRev.2009;28(5):703724.,肾小球肾炎,正常组多肽模式：173个在90%以上正常人尿液中出现的多肽，690个在50%以上正常人尿液中出现的多肽，疾病分别构建了含500个以上多肽模式对疾病分类的准确性：MCD/FSGS71.4%，MN92.9%。,KidneyInt,2004,65(6):2426-34KidneyInt,2005,67(6):2313-20MassSpectromRev.2009;28(5):703724.,狼疮性肾炎,Mosleyetal.(2006)SELDI-TOFMS差异蛋白：m/z3340和3980Da活动和非活动LN：敏感性和特异性均92%预测LN的复发与缓解未作进一步鉴定,active(n=26)andinactive(n=49)lupusnephritispatientsROCcurveforthetwobiomarkerswasgeneratedusinglogisticregressionscores,withanareaunderthecurveof0.967.,狼疮性肾炎,Suzukietal.(2009)SLE或青少年特发性关节炎：8种生物标记物m/zof2.7,22,23,44,56,79,100,133kDa（LN）鉴定：23-kDa：脂质运载蛋白型前列腺素-D合成酶(L-PGDS),56-kDa：1酸性糖蛋白(AGP)or类粘蛋白(orosomucoid,ORM)79-kDa：转铁蛋白(Tf),133-kDa：铜蓝蛋白(Cp)其它：白蛋白或白蛋白片段这些蛋白可能可作为预测LN病程,PediatrRes.2009May;65(5):530-6.,狼疮性肾炎,Zhangetal.(2008)方法：SELDI-TOF-MS选择27/176种差异表达蛋白（不同活动期）3中低分子生物标记物Hepcidin的20、25氨基酸异构体1-antitrypsin片段白蛋白肝性杀菌肽(hepcidin)：与LN促炎症细胞因子有显著相关意义,KidneyInternational74,799807(2008),UrineSELDIspectraofclassIVSLEnephritisflarecycles.(a)Thespectraofawholeflarecyclearepresentedbetweenthe2000and10,000Daregion.TheLMWurineproteomeshowsanoverallincreaseinpeaksbetween2000and4000Daasflareapproaches,whichthendecreaseduringflaretreatment.,(b)Thespectrafrom4monthspre-flareandflareofaclassIVGNpatientshowingthatsomeproteinionsdecreaseattheflare.,Intrarenalexpressionofhepcidin.Immunohistochemicalstainingforhepcidinisshownforrenalbiopsymaterialfromanormalkidney(CONT),andthreepatientswithclassIVSLEnephritis(SLE).Thepositivecellsareinfiltratinginterstitialleukocytes.,甘露聚糖结合凝集素(mannosebindinglectin,MBL)与造影剂引起的急性肾损伤(CIN)有关凝集素途径可能参与造影剂致肾损伤MBL:CIN可能的生物标记物,造影剂肾损伤,ARF,Exosomalfetuin-A:biomarkerofAKI大鼠ARF模型-患者Westernblots证实ischemicARF:血浆谱:NGAL、cystatinC尿谱:NGAL,IL-18,KIM-1,cystatinC,a1-MG,fetuin-A,Gro-alpha,meprin.评价ARF的持续时间和严重性预测疾病的进展和不良临床预后有助于区分ARF的不同病因学,KidneyInt.2006;70:18471857.CurrOpinNephrolHypertens.2008;17:127132,肾脏纤维化机制研究,PhosphoproteomicStudyofHumanTubularEpithelialCellinResponsetoTransformingGrowthFactor-1-InducedEpithelial-to-MesenchymalTransitionYong-XiChen,YaLi,Wei-MingWang,WenZhang,Xiao-NongChen,Yin-YinXie,NanChenAmJNephrol2010;31:2435利用同位素标签技术（iTRAQ）对TGF-诱导人肾小管上皮细胞损伤过程中磷酸化蛋白的蛋白质组学研究,结果：TGF-可致肾小管上皮细胞损伤,转分化-形态学改变,转分化-形态学改变,促凋亡-流式,促凋亡-流式,结果：磷酸化蛋白富集,1,2,3,1,2,3,1,2,3,3,3,2,1,1,2,结果：iTRAQ-2D-nano-HPLC-MS/MS分析,本次质谱鉴定检测到2493个质谱峰(spectra)鉴定出1298个质谱峰，所有检测出质谱峰52.1%（1