褚泰伟《应用化学基础》第九章放射性在化学中的应用

1,第九章放射性示踪技术在化学、生物研究中的应用,2,证明DNA是遗传物质,历史上，生物学家在细胞中总是没有办法找到承担遗传功能的物质，曾经一度认为蛋白质是遗传物质，因为它承担了生命活动的绝大部分功能。,1952年赫尔希(Hershey)和沙斯(Chase)两人利用噬菌体证明了DNA的遗传功能，为最终确立DNA是主要的遗传物质奠定了基础。他们把宿主细菌分别培养在含有35S和32P的培养基中,宿主细菌在生长过程中，就分别被35S和32P所标记。然后，赫尔希等人用T2噬菌体分别去侵染被35S和32P标记的细菌。噬菌体在细菌细胞内增殖，裂解后释放出很多子代噬菌体，在这些子代噬菌体中，前者被35S所标记，后者被32P所标记。,3,接着，他们用被35S和32P标记的噬菌体分别去侵染未标记的细菌，然后测定宿主细胞的同位素标记。当用35S标记的噬菌体侵染细菌时，测定结果显示，宿主细胞内很少有同位素标记，而大多数35S标记的噬菌体蛋白质附着在宿主细胞的外面；当用32P标记的噬菌体感染细菌时，测定结果显示宿主细胞的外面的噬菌体外壳中很少有放射性同位素32P，而大多数放射性同位素32P在宿主细胞内。以上实验表明，噬菌体在侵染细菌时，进入细菌内的主要是DNA，而大多数蛋白质在细菌的外面。可见，在噬菌体的生活史中，只有DNA是在亲代和子代之间具有连续性的物质。因此，DNA是遗传物质。由此，Herhey于是1962年获诺贝尔奖。,4,放射性分子检测技术概述：1、1952年，Hershey和Chase以32P和35S分别标记T2噬菌体的DNA与蛋白质、标记T2噬菌体大肠杆菌，直接证明了DNA是遗传物质。由此，Herhey于是1962年获诺贝尔奖。2、1958年，Meselson和Stahl使用15N（15NH4Cl）示踪技术，确证了DNA的半保留复制模型，阐明了DNA自身复制的机制。,5,3、1956年，Kornberg等用32P标记DNA的前身物脱氧鸟苷三磷酸等的第一个磷酸，证明大肠杆菌抽出液中存在DNA聚合酶（经后人证明这种酶是DNA损伤时一种修复酶。A、Kornberg于1959年获诺贝尔奖。）4、1963年、Bermardhall等用3H标记DNA，32P标记RNA，证明了DNA在RNA合成过程中起模板作用。5、1968年，Nirenberg(1961)，由于其14C一苯丙氨酸的多肽化被确证（证明遗传信息是从DNA通过mRNA传递到蛋白质即“中心法则”，又称遗传密码的翻译一的直接实验）而获诺贝尔奖。还有DNA的重组（32P、3H），近20年的分子生物成就。,6,7,9.1.放射性核素示踪法,示踪剂是一种带有特殊标记的物质，当它加入到被研究的对象中后，人们可以根据示踪剂的运动和变化，来洞悉原来不易或者不能辨认的被研究对象的运动和变化规律。将已知总放射性的示踪剂（Cr-51-红细胞）注入血液循环。待混合稀释后（一般在注射后10-15min）抽取一个血液样品，测定每毫升的放射性，就能算出待测的人体血容量。此法不需要处理样品，快速而准确。,8,灵敏：可示踪微量物质的性质和行为1Ci的32P相当于61010个32P原子，质量仅为10-12g。一般的放射性探测器可定量测定1nCi的放射性，因此可检测的放射性核素的量为10-1310-19g。,9.1.1放射性核素示踪法的特点,灵敏度高化学分析法：一般10-6g光谱法：10-1010-12g示踪法：10-1410-18g例32P：A(Bq)3.7104质量（g）3.510-12很容易测量3.7Bq,9,10,简单，易分辨：通过各种射线探测仪测量放射性来定量或定性，不受非放射性物质的干扰；勿需分离提纯；在生物、医学研究中可从体外测量，不影响正常生物活动。,9.1.1放射性核素示踪法的特点,11,提供原子、分子水平的研究手段：化学平衡时的反应速率，有机化合物的分子重排，异构化、反应机理；模拟水平高：模拟真实的环境条件。由于用量少，不影响生物体的正常生理过程，不影响环境过程的正常变化。可用于研究药物的毒理、环境的变化。,9.1.1放射性核素示踪法的特点,12,定位可靠：在生物和环境研究中，不仅能准确定量测量，而且可以用放射性自显影技术确定其在组织器官中的分布情况，与病理组织的切片技术结合，可进行细胞水平的定位；与电子显微镜技术结合，可进行亚细胞水平的定位观察。,9.1.1放射性核素示踪法的特点,13,9.1.2放射性示踪法的分类,简单示踪法：在所研究的物质中加入放射性物质，二者简单地混合，根据放射性物质的运动情况，考察研究对象的运动规律。放射性浮标测密封容器中的液面高度；46Sc加到流沙中，研究流沙的运动和沉降规律；131I跟踪白蚁的活动规律。,14,9.1.2放射性示踪法的分类,物理混合法：示踪剂与研究对象均匀混合，使其比例保持不变，通过对示踪剂的测量，可定量地研究研究对象的性质和行为。32P标记测量人体的血液总体积（将一定量的32P注入人体，混合一定时间后，抽取一定量的血液）V=V0(s0/s+1),15,9.1.2放射性示踪法的分类,同位素示踪法：根据同位素具有相同化学性质的特点，用放射性同位素（或其标记化合物）作为被研究元素或化合物的示踪剂；示踪剂能正确地反映研究对象在物理、化学和生物过程中的性质和行为。,16,9.1.3放射性示踪剂的选择,根据实验目的和要求进行选择：半衰期：根据实验目的和实验周期，选择半衰期适当的放射性核素；在2500多种放射性核素中，t1/21h的约占50%，1h24h的约占20%，1d的约占30%。,17,9.1.3放射性示踪剂的选择,目前常用的有200多种放射性核素；半衰期太短要求操作简便省时，测量快速；半衰期太长测量困难，难获得高比活度样品；一般选择数小时t1/2数百天体内使用的放射性核素，在能满足示踪要求的前提下，尽量选择短半衰期的核素。,18,9.1.3放射性示踪剂的选择,辐射类型和能量：既要考虑便于测量，也要考虑辐射效应；一般不用放射性核素（治疗用），常用和核素；射线核素探测效率高，易于防护(32P,Emax=1.709MeV;3H,Emax=0.00186MeV);,19,9.1.3放射性示踪剂的选择,射线核素穿透性好，一般选用能量在100600keV的射线；在该能量范围内，既可穿透机体，被扫描仪或照相机的探头所记录，又不至于穿透扫描仪或照相机的准直器而影响空间分辨率；用于脏器扫描的射线核素最好不发射射线、内转换电子和Auger电子，这些射线只增加病人的吸收剂量，而不能提供有用信息。,20,9.1.3放射性示踪剂的选择,放射性活度：使用过程中往往被稀释，要求原始比活度高；但由于安全因素，比活度不宜过高；一般根据稀释倍数、最后测量的量和测量效率来确定适当的比活度.,21,9.1.3放射性示踪剂的选择,放射性核素的纯度：生产中，由于副反应、靶物中存在杂质，使放射性不纯，影响实验结果；医学应用中，放射性杂质会增加病人的吸收剂量，影响诊断和病人健康；使用之前，要进行纯度检验。,22,9.1.3放射性示踪剂的选择,放射性核素的毒性：尽量使用低毒性核素。若有毒，要尽量控制用量。生物半衰期：选用生物半衰期短的核素。,23,同位素效应：对于较轻的元素，由于原子量的倍数差异较大，使他们的化学性质显著不同，必须考虑。同位素效应随着原子序数的增大而减小。核衰变及辐射自分解：衰变生成子体以及自身电离辐射作用下产生自分解，使纯度受到影响，引起实验误差。降低放射性比活度或将标记分子稀释分散，可使辐射自分解显著减小。,9.1.4放射性示踪法中应注意的几个问题,24,9.2放射性核素在化学中的应用,9.2.1在化学反应机理研究中的应用鉴别化学反应中有关的化合物鉴别化学反应的中间产物研究反应中各中间产物的前后次序确定化学键断裂的位置研究大分子的形成过程,25,一、鉴别化学反应中有关的反应物,在14CO2参加植物的光合作用中，在见光短时间内，可以从植物中分离得到三十多种含有14C的化合物。可以得知，这些化合物都是由CO2开始的光合作用生成的。最终产物的前身是什么？用13C标记有可能是尿酸前身的各种化合物喂给鸽子，然后分析排泄物中的尿酸。结果发现，碳酸盐、甲酸盐、醋酸盐等都参加了尿酸的合成反应。,假如反应经过ABC，从A到C是否经过了中间产物B。可采取以下步骤：,26,二、鉴别化学反应的中间产物,在体系中加入A*，检查B中是否有A*出现。在体系中加入B*，检查C中是否有B*出现。在体系中加入大量非放射性的B，检查C中的B*是否减少。如果答案是肯定的，说明有中间过程（应排除同位素交换）；如果答案是否定的，则无中间过程。,例如：从铬酸盐溶液电解制金属铬，是否有Cr(III)中间产物。将51Cr标记在铬酸盐(A)上，沉积物(C)有放射性，但将51Cr标记在Cr(III)上(B)，沉积物中没有放射性，已经证明Cr(III)与铬酸盐的同位素交换非常慢，因此可以证明Cr(III)不是中间产物。,27,三、研究反应中各中间产物的前后次序,例：已知碘化物进入人体后，可生成一碘酪氨酸、二碘酪氨酸和甲状腺素，为了研究这一过程，可将用I-131标记的碘化物注入动物体内，在不同时间测出动物体内上述三种有机物的比放射性活度，结果发现：在开始的短时间内（10分钟），一碘酪氨酸的放射性最强，几小时后，一碘酪氨酸与二碘酪氨酸的比放射性几乎相同，但比甲状腺素强，直到2-3天后，最终产物的放射性比活度与前两个产物相等，因而可得中间产物顺序为：碘化物-一碘酪氨酸-二碘酪氨酸-甲状腺素,28,四、确定化学键断裂的位置,在研究化合物降解时，常常需要知道化学键断裂的位置。例如：丙酸氧化时，产物为CH3COOH和CO2，到底断开的是哪一个C-C键，可以用示踪方法确定。又如分子重排反应机理，也常用示踪原子方法。,29,30,克莱森重排：苯丙烯醚重排成为邻丙烯基苯酚,表面上看，似乎是O-CH2键断裂,31,确定示踪剂的位置为：,说明克莱森重排是分子内重排,五、研究大分子的形成过程,示踪原子方法在研究大分子在生物体中形成过程中有很重要的意义。例如：研究动物脂肪酸的形成过程，将CH3*COOH注射到山羊体内，分析羊乳脂肪样品，发现脂肪酸中的丁酸在羧基和碳原子上有*C，分子式为：CH3*CH3CH2*COOH，这表明丁酸是由两个醋酸分子缩合而成的。还发现己酸中的*C是间隔出现在碳链上，且-*COOH上特别强。这表明，己酸是分步合成的。即：先生成有*C的丁酸，随后被非放射性的丁酸所稀释，最后与第三个醋酸分子缩合。,32,33,9.2.2在化学中的其他应用,分配比和分离因数的测定配合物稳定常数的测定溶液中自扩散系数的测定扩散物质在球形固体中的自扩散系数的测定金属自扩散系数的测定晶体比表面的测定溶解度的测定,一、分配比和分离因数的确定,分配比(distributionratio)：两相中各种形式总浓度之比。Di=i/Cii-mmol/g分配系数(distributioncoefficient)：两相中平衡浓度之比。i=Mi/CiMi-mmol/ml分配比和分配系数都是用来表示交换反应中某一离子在平衡分配时的参数，其区别在于固相浓度的表示方式不同，因而其应用场合不同。,34,选择系数(selectivitycoefficient)：表示两种离子对树脂亲和力的差别。例如：对反应aA+bBaA+bBKAB=AaBb/AaBb选择系数的数值因采用的浓度单位不同而异。选择系数越大，表示A、B两种离子对树脂的亲和力差别越大。,35,分离因数(separationfactor)：分离因数表示两种离子在达成离子交换平衡后所取得的富集效果。AB=(A/B)/(A/B)=DA/DB分离因数从数值上等于平衡分配时A和B组分在树脂相的浓度比对溶液相的浓度比的商值。分离因数和选择系数的差别在于它与参加交换的离子价数无关。,36,用放射性示踪原子的办法，可以很容易测得上述各种参数。方法是：将放射性标记的待测核素配成溶液，然后加入一定量的树脂，分别测量原始溶液和平衡时溶液的放射性活度，即可计算出平衡时固液两相的放射性活度，以此可以可以计算出分配比等参数。,37,二、配合物稳定常数的测定,一、测定原理关键是引入配合度和函数。然后逐级外推，即可求得1、2n。二、实验方法：通常是先用实验求得无配体时的分配比D和有配体时的分配比D，以log(D/D-1)对logL作图，从直线截距可求得logn，由斜率求得配位数n。由于示踪原子方法灵敏度高，可以在中心离子浓度非常低时进行。,38,三、溶液中自扩散系数的测定,在浓度不均匀的体系中，发生物质的均匀扩散(浓差扩散)，可用Fick第一定律来描述J=-D(c/x)J是扩散物质的流量，c为扩散物质的浓度，x为扩散方向上的坐标(距离)，D为扩散系数。负号表示扩散是沿着浓度减小(c/xWx：Wx=WOSm/So,48,49,显然，在上述方法中必须从体系分出一部分待测物，并测定其放射性比活度，这就需要用重量法或其它的物理化学方法来分析测定所分出的那一部分纯物质的准确含量。可见，经典的直接同位素稀释法灵敏度实际上取决于其它分析方法，分析的灵敏度受到限制。,50,（三）亚化学计量稀释法：亚化学计量同位素稀释法(SubstoichiometricIDA)是要在分析操作中创造一个分离条件，使得从标准溶液和经过稀释的样品溶液中分离出来的待测物的重量相等，那么它的放射性比活度之比就等于放射性强度之比，此时上式就可改写成：,式中A0和AX分别是从标准溶液和待测溶液中分离出来的等重量物质的放射性强度。由于该法只要根据同位素稀释前后分出样品的放射性强度之比就能求得待测物的含量，此法的灵敏度可以大大提高。通常A0AX，所以,51,当溶液中金属离子的含量相对于反应剂来说是过量的，反应剂将全部与金属离子作用。因此，只要向标准溶液和待测溶液中加入完全相等的亚化学计量反应剂，经过同样的化学分离方法就可分离出等量的金属离子。溶剂萃取，离子交换，沉淀，电解，吸附等方法均可用作亚化学计量法的分离方法。其中萃取法最为常用。例如：实验用铟的放射性同位素113mIn作为示踪原子，用标准的稳定铟作标准曲线，从而求出未知稳定铟溶液的浓度。由于8-羟基喹啉与铟在pH3-5时定量反应，生成的8-羟基喹啉铟溶于氯仿，因此，用亚化学计量的8-羟基喹啉-氯仿溶液定量萃取部分铟，再测量放射性。作AX对1/WX图