第一章-分离方法.ppt

1,第三节提取分离方法,天然药物化学成分复杂，在研究和应用其所含的有效成分时，必须将它们从药材中提取、分离出来，这是研究天然药物化学成分的重要步骤。,2,一般来说，中药的提取是指从原药材中将化学成分提出的过程。所得的提取物中，通常仍包含多种性质相似的化合物。分离是指把提取物中所含的各种成分一一分开，最后把得到的单体加以精制的过程。,3,在进行提取前，应对所用材料的基源、产地、药用部位、采集时间与方法等进行考察，并系统查阅文献，以充分了解前人的经验。中药材料在提取前应进行适当的预处理，如粉碎、酸化等。,4,目标物为已知成分或已知化学结构类型工业化生产方法目标物为未知有效成分或有效部位系统溶剂分离法活性跟踪分离法,5,按提取原理分类：（一）溶剂提取法（二）水蒸气蒸馏法（三）升华法溶剂法最为常用。,一、中草药有效成分的提取,6,1溶剂提取法的原理：相似相溶理想溶剂：有效成分溶解性大，无效成分溶解性小，与植物成分不起化学反应；安全、成本低；,（一）溶剂提取法,7,溶剂分类水,亲水性有机溶剂：如甲醇、乙醇、丙酮,亲脂性有机溶剂：石油醚、饱和烷烃、氯仿、苯、乙酸乙酯,注意：共存物的影响,糖苷，氨基酸,萜类、甾体类、芳香类,8,溶剂极性大小,水、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、石油醚、环己烷,极性：大小亲脂性：小大亲水性：大小,9,2、溶剂法分类,（1）浸渍法：药材+溶剂浸泡提取物（2）渗漉法：药材粉碎后，加入渗漉桶中,（3）煎煮法（4）回流提取法（5）连续回流提取法,冷提,热提,（6）超临界流体萃取技术（7）超声波提取技术（8）微波提取法,10,（1）浸渍法：室温、稀乙醇,适用：遇热不稳定，含大量淀粉、树胶、果胶、粘液质的中药缺点：时间长，效率不高；出膏率低；溶剂用量大；用水为溶剂时，提取液易于发霉,11,(2)渗漉法：室温、稀乙醇,不断向粉碎的中药材添加新鲜的浸出溶剂缺点:消耗溶剂量大、费时长、操作比较麻烦,12,（3）煎煮法：水,简便缺点：含挥发性成分或有效成分遇热易分解的中药材不适用,13,（4）回流提取法：有机溶剂,用易挥发的有机溶剂加热回流提取缺点：热不稳定的不能用，溶剂消耗量大，操作麻烦,避免有机溶剂的挥发，一般提取三次,14,（5）连续回流提取法,常用索氏提取器完成，弥补了回流提取法中溶剂消耗量大，操作太烦琐的不足时间长，不适应受热分解的成分,15,药材,16,（6）超临界流体萃取技术物质处于其临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上状态时，成为单一相态，将此单一相态称为超临界流体（SF）。超临界流体特点:兼有气、液两重性，即密度接近于液体，而粘度和扩散系数又与气体相似，因而它不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有优良的传质效果。,17,在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，通过控制不同的温度、压力以及不同种类及含量的夹带剂，使超临界流体有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。称为超临界流体萃取技术。,原理：,18,临界温度低(Tc=31.3)临界压力小(Pc=7.15MPa)无色、无味、无毒、不易燃、化学惰性、低膨胀性、价廉、易制得高纯气体等特点，现在应用最为广泛。,可作为SCF的物质：,二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、甲醇、氨和水等,二氧化碳：,19,超临界流体萃取技术的优点：1）操作范围广，便于调节；2）选择性好；3）萃取、分离一步完成；4）溶剂回收简便，且可循环使用；5）萃取效率高，速度快；6）低温操作，特别适合于热敏性组分；7）可以调节萃取物的粒度；8）无有机溶剂残留。,20,局限性,1、对脂溶性成分溶解能力强，而对水溶性成分溶解能力弱2、设备造价高3、难清洗,21,（7）超声波提取技术采用超声波辅助提取溶剂进行提取的方法。超声波为弹性震动波。可造成植物细胞壁及整个生物体的瞬间破裂，使溶液能渗透到药材的细胞中。,优点：不改变有效成分的结构；缩短提取时间、提高提取率。,22,(8)微波提取法,原理：分子对微波具有选择性吸收，极性分子可吸收微波能，然后弛豫，以热能形式释放能量，使介质内部温度迅速上升，造成内部压力过大，导致成分流出溶解于溶剂中；微波所产生的电磁场可使部分成分向萃取溶剂界面扩散，加速其热运动，缩短提取时间，提高效率，降低了提取温度。,23,（二）水蒸气蒸馏法,适用于具有挥发性的、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、且难溶或不溶于水的成分的提取。沸点多在100以上，并在100左右有一定的蒸汽压原理：两种互不相溶的液体共存时，各组分的蒸气压和它们在纯粹状态时的蒸气压相等，而另一种液体的存在并不影响它的蒸气压，混和体系的总蒸气压等于两纯组分蒸气压之和。挥发油多用此法,24,25,固体物质受热时不经过熔融直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结为固体的现象如樟木中樟脑的提取，茶叶中的咖啡因等,（三）升华法,26,二、中草药有效成分的分离与精制,（一）根据物质溶解度差异进行分离（二）根据化合物在两相溶剂间分配比不同进行分离（三）根据物质的吸附性差别进行分离（四）根据物质分子大小差别进行分离（五）根据物质离解程度不同进行分离,27,（一）根据物质溶解度差别1、结晶与重结晶：利用温度不同，溶解度改变分离。,待纯化物A+杂质B、C,加MeOH热溶热滤,残渣（C）,滤液（A+B）,冷置析晶,母液（B）,结晶（A）,合适溶剂：对有效成分与杂质在冷热情况下溶解度显著差异。,28,水/醇法：水提液+醇（数倍）：多糖、蛋白质除去。醇/水法：醇提液+水（数倍）：叶绿素、树脂除去。醇/醚法（醇/丙酮法）：纯化皂苷,加另一种极性相差较大的溶剂混合溶剂极性改变部分物质沉淀析出,2、改变混合溶剂极性,29,例子：水/醇法,中药水提取液,加数倍量浓醇静置过夜,母液（目标成分）,沉淀（水溶性杂质）,（如蛋白质、多糖、果胶、粘液质）,30,3、改变pH值,酸、碱、两性成分调节PH改变分子存在状态改变溶解度A酸/碱法（酸提取碱沉淀法）：生物碱的提取、纯化B碱/酸法（碱提取酸沉淀法）：黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化C.调节PH至等电点，沉淀蛋白,A酸/碱法（酸提取碱沉淀法）生物碱的提取、纯化,B碱/酸法（碱提取酸沉淀法）黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化,33,4、金属盐络合法：,酸、碱成分加入某种沉淀试剂水不溶性盐A酸性成分Pb2+、Ba2+、Ca2+水悬浮，通H2S母液（）B.碱性化合物苦味酸/苦酮酸，磷钼酸/磷钨酸/镭氏盐强H+，Et2O萃取H2O层（）,34,（二）根据化合物在两相溶剂中的分配比不同进行分离,液-液萃取法逆流分溶法（CCD）液滴逆流色谱法（DCCC）高速逆流色谱法（HSCCC）气液分配色谱法（GC或GLC）液-液分配色谱法（LC或LLC）,35,1、液液萃取与分配系数K值K=CU/CL,液液萃取的基本原理,在一定温度和压力下为常数。,36,2、分离难易与分离因子,100，简单萃取10010，须萃取10-12次2时，100以上萃取才能完成1时，无法分离,=KA/KB（KAKB），表示分离难易,37,3、分配比与PH对于酸、碱及两性化合物，pH改变可使存在状态改变,影响分配比。,HA+H2OA-+H3O+,Ka=A-H3O+/HA,pH=pKa+lg(A-/HA),38,若使酸性物质完全离解，,pH=pKa+lg(A-/HA)pKa+lg（100/1）,故pHpKa+2,使酸性物质完全游离，即A-均转变为HA,则pHpKa-2,39,酚类pka一般为9.2-10.8pH12解离型羧酸类pKa一般为5pH7解离型,40,碱性化合物与此相反:pH12主要为游离型pHAr-OHH2OR-OHR-NH2RCONH2RCHORCOORR-ORR-XR-H,55,(2)化合物的极性,由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素决定,CH,(CH2)16,COOH,56,对于骨架相同的化合物，根据所含取代基的极性判断分子的极性强弱。骨架相同，取代基数目和种类不同，如果数目相差不大，含有极性最大的化合物的极性最强。,57,骨架不同，取代基数目相差较大时，要具体情况具体分析。,CH3(CH2)16COOH,极性,58,黄花夹竹桃果仁中的强心苷,1,2,3,4,5,6,7,59,（3）溶剂的极性,介电常数越大，极性越强乙烷苯乙醚氯仿乙酸乙酯乙醇甲醇水,60,4、聚酰胺吸附色谱法,半化学吸附氢键吸附极性物质与非极性物质均可适用适合酚类、醌类、黄酮类化合物,61,聚酰胺的性质及吸附原理,性质：为高分子聚合物，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、酮等，对碱稳定；溶于浓盐酸、冰酸、甲酸。,62,（1）形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。,吸附能力：,63,（2）成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。,64,（3）分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。,65,(4)芳香苷元相应苷；单糖苷双糖苷叁糖苷,66,影响因素-溶剂的影响,吸附环境：水或低浓度醇中。洗脱能力由弱至强：水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液,67,聚酰胺色谱的应用,适用于酚类、黄酮、醌类对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等也有广泛的用途用于脱鞣质,薄层色谱和柱色谱两种形式。,68,判断下列化合物在硅胶吸附色谱和聚酰胺色谱柱的色谱行为：,69,5、大孔吸附树脂,高分子吸附材料白色球形颗粒非极性和极性两种理化性质稳定,70,（1）大孔吸附树脂的吸附原理,以苯乙烯、-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂甲酰胺聚合而成吸附性（范德华力及氢键）与分子筛性（多孔结构）结合。,71,（2）影响吸附的因素,1）吸附剂的表面性质：如比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键,2）被吸附的化合物结构的影响：A、非极性化合物在水中易被非极性大孔树脂吸附；极性化合物在水中易被极性大孔树脂吸附。B、物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小；反之就大。C、能与大孔吸附树脂形成氢键的化合物易被吸附。,72,3）洗脱剂的影响：,极性越小，洗脱能力越强一般先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增高的乙醇、甲醇洗脱多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质会随着水流出、极性小的物质后洗出,73,（3）大孔吸附树脂在中药研究中的应用,应用：广泛用于天然化合物的分离和富集工作,苷与糖的分离，苷类、生物碱的富集，黄酮类、三萜类化合物的分离等。,74,（四）根据物质分子大小差别进行分离,透析法凝胶过滤法超滤法超速离心法,75,1、凝胶过滤法（凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱等）,（1）分离物质的原理：分子筛，按分子由大到小顺序出柱,76,（2）凝胶的种类与性质,葡聚糖凝胶（SephadexG）只适于在水中应用不同规格适合分离不同分子量的物质羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）可在水及有机溶剂中使用。在由极性及非极性溶剂组成的混合溶剂中常起到反相色谱的作用。,77,（五）根据物质离解程度不同进行分离,离子交换法电泳技术,78,1、离子交换法分离物质的原理,以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱流动相经过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，具有可交换的离子则从树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件，用适当溶剂从柱上洗脱下来。,79,2、离子交换树脂的结构及性质,母核部分离子交换基团阳离子交换树脂-强酸性(-SO3-H+)、弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂-强碱性（-N+(CH3)3Cl-）、弱碱性（-NH2,-NH-,-N-）,阴离子交换,阳离子交换,80,小结,1、中草药成份提取方法溶剂法：各自的适应范围及优缺点-浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法水蒸气蒸馏法：对物质的性质要求升华法,81,2、中草药成份分离方法,根据物质溶解度差异进行分离：-结晶法、水/醇法、醇/水法、酸/碱法、碱/酸法等各自适应分离什么类型的化合物根据化合物在两相溶剂间分配比不同进行分离-液液萃取法原理、正相色谱和反相色谱根据物质的吸附性差别进行分离-硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、大孔吸附树脂的吸附规律、原理根据物质分子大小差别进行分离-分子筛的原理根据物质离解程度不同进行分离-离子交换树脂的原理,82,第四节结构研究法,83,一、化合物的纯度测定,物理常数：mp，晶形、色泽是否均一各种色谱方法1）TLC（PC）：三种展开系统均为单一斑点。2）GC，HPLC,84,二、结构研究中采用的主要方法,质谱红外光谱紫外-可见吸收光谱核磁共振谱,85,（一）质谱（MS）,质谱常用于确定分子量，并可求算分子式和提供其它结构信息。在一定条件下化合物的开裂遵循一定规律,86,电子轰击法（EI-MS）,应用最普遍的含有丰富的碎片离子信息缺点：容易分解的化合物或难以气化的化合物，测不到分子离子峰,只有碎片峰；大分子物质难以气化而无法测定,87,软电离法,化学电离质谱（CI）场解析电离质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）等。,88,基峰,89,MS图横坐标是m/z，纵坐标是离子峰的相对强度.MS图中相对强度最大的离子峰称为基峰，其强度定为100%，其他离子峰的强度分别以它们对基峰的相对强度百分比来表示。离子峰的强度与对应离子的数量成正比，离子的数量越多，峰的强度越大。,90,分子离子峰M+.碎片离子峰同位素离子峰常出现在分子离子峰的右边1-2个质量单位，用M+1、M+2表示。,3、MS中常见的几种离子峰,91,（二）红外光谱（IR）,利用分子中价键的伸缩及弯曲振动在4000-625cm-1红外区域引起的吸收，而测得的吸收图谱。包括特征频率区（4000-1500cm-1）和指纹区（1500-625cm-1）提供各种官能团信息,92,红外识别的特征官能团,羟基大于3000cm-1，游离羟基大于3600cm-1C=C1680-1620cm-1CC2150cm-1C=O1705-1725cm-1苯环1450-1600cm-1,93,羟基,羰基,特征区,指纹区,94,（三）紫外-可见吸收光谱（UV-vis）,由电子能级跃迁产生的吸收图谱，在200-700nm范围内分子中有共轭双键、,-不饱和羰基及芳香化合物的结构鉴定,常用于推测化合物的骨架类型香豆素、黄酮类物质常用，加入诊断试剂后可因取代基的类型、数目及排列方式的不同而发生改变，可用于测定化合物的精细结构.,95,96,（四）核磁共振谱（NMR）,1、氢核磁共振谱（1HNMR）,横坐标：化学位移；纵坐标：积分曲线的高度1HNMR谱图所提供信息：化学位移1H的类型、积分面积1H的数目裂分情况相邻原子或原子团情况。,97,98,（1）化学位移（chemicalshift,）：,各个1H核共振吸收峰与原点之间的相对距离。影响化学位移的主要因素电子云密度和磁向异性效应电子云密度降低，去屏蔽作用增强，向低场位移，化学位移值增大；反之向高场位移，化学位移值减小。,99,A.诱导效应；B.共轭效应；C.氢键效应等。,影响电子云密度的因素：,如：CH3FCH3ClCH3BrCH3ICH44.263.052.682.160.23,100,-CHO910ppm芳环-H69ppm-C=C-H58ppm-CC-H23ppm-CH2-CH2-0.81.8ppm.活泼氢不定(加D2O消失)（-OH、-NH、-SH）,不同类型质子化学位移的大致范围,101,-C=C-CH3,COCH3,ArCH31.9-2.5ppm-OCH33.5-4.0ppm-COOCH3,ArOCH33.5-4.0ppm,(2)峰面积,积分面积与分子中的总质子数相当，如分子式已知，可算出每个信号所代表的质子数。,C14H22O,103,（2）信号的裂分及偶合常数（J）,峰的裂分：由单峰分裂成多重峰的现象磁不等价的两个或两组1H核在三个单键以内因相互自旋偶合而使信号发生分裂。裂分峰类型：s(singlet)、d(doublet)、t(triplet)、q(quartet)、m(multiplet)等。,104,特点：,裂分峰之间共振吸收位置之差即为偶合常数J，单位为Hz。间隔键数越少，J的绝对值越大。低级偶合系统中，裂分遵循n+1规律，其中n为干扰核的数目通常，超过三根单键以上的偶合可以忽略相互偶合的H核其偶合常数（J）相等,105,相隔键数：越少，J大,2JH-H偶合同碳偶合，在直链化合物中一般观测不到,通常为3JH-H偶合,a,b,106,（n+1）规律即有机化合物分子中，某质子的相邻碳上有n个磁等