（李廷群）论文β－内酰胺类抗生素簇特异性抗体制备研究

内酰胺类抗生素簇特异性抗体制备研究李廷群 邱蓉1.材料与方法1.1 主要材料1.1.1 试剂注射用氨苄西林钠（购于华农大校医院）动物用青霉素牛血清白蛋白（BSA）卵血清蛋白（OVA）弗氏完全佐剂（FCA）弗氏不完全佐剂（FIA）酶标羊抗小鼠NN二甲基甲酰胺（DMF）25%戊二醇30双氧水(H2O2)马血清1.1.2 主要仪器各种规格移液枪恒温磁力搅拌器4和20冰箱酶标仪紫外分光光度计电子天平恒温水浴箱冷冻离心机1.1.3 其它材料 透析袋（新透析袋的处理：用蒸馏水煮沸10min，冷却至室温即可使用）96孔酶标板一次性注射器（1ml）离心管剪刀、镊子1.1.4 ELISA各种试剂的配制（1）包被液（0.1M、PH9.6碳酸盐缓冲溶液）：将0.636g Na2CO3和1.172g Na2HCO3加到200ml蒸馏水中，装入试剂瓶中4保存备用。（2）PBS贮存液（PH7.4，20倍）：4g KH2PO4, 58g Na2HPO412H2O, 4g KCl, 定容到1000ml，室温贮存。（3）PBST洗涤液（0.01M、PH7.4）：取上述配备的PBS贮存液100ml，加入17g NaCl，再加入1900ml蒸馏水，加入1ml Tween20，混匀，室温贮存，长期贮存期间出现浑浊，不能用，另配。（4）稀释液：取100ml PBST洗涤液，加入0.1g 明胶溶解，明胶比较难溶解，37水裕放置1小时，过滤即可，4下保存（一个星期内有效）。（5）底物缓冲液（PH5.0）：0.933g 柠檬酸，3.689g Na2HPO412H2O，定容到200ml，4贮存（1个月内有效）。（6）底物贮存液（发黄不可用）：80mg 邻笨二胺溶于10 ml底物缓冲液中，分装贮存（0.5ml/支），怕光，操作快速，-20贮存。（7）显色液：临用前现配，取0.5ml底物贮存液避光快速解冻，加入9.5ml底物缓冲液，再加入16l 30过氧化氢（H2O2），立即用，用后剩余的丢弃。（8）终止液（10硫酸）：取10ml浓硫酸，加入到90ml蒸馏水中，室温贮存。（9）封闭液：2的马血清。1.2 实验内容1.2.1 抗原的合成（1）青霉素戊二醛载体蛋白复合物的制备：0.0145g氨苄青霉素溶解于1ml二甲基甲酰胺中，然后加到2ml溶有0.0248g 载体蛋白的PH值为7.4、浓度为0.15M的PBS溶液中。接着，在上述混合液中逐滴加入18.75l 25的戊二醛。在室温下用磁力搅拌机轻柔搅拌3h后，将反应物取出，在透析袋中用0.9的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。透析好的反应物分装后，保存于-20冰箱中。（2）青霉素载体蛋白复合物的制备：将50mg青霉素溶于2ml碳酸钠碳酸氢钠缓冲溶液中，加入30ml载体蛋白，在37下恒温18h，取出反应物用0.9的生理盐水透析3天，每24h换生理盐水3次。透析好的反应物分装后，保存于-20冰箱中。1.2.2 免疫抗原和合成抗原的合成按照上述两种方法，分别用BSA（牛血清白蛋白）和OVA（卵血清蛋白）作为载体蛋白，合成完全抗原。其免疫抗原分别为氨苄青霉素BSA和青霉素BSA，其包被抗原分别为氨苄青霉素OVA和氨苄青霉素OVA。1.2.3 完全抗原的鉴定 将合成的完全抗原、载体蛋白和原药按照合成的比例分别稀释到合适的浓度，然后分别对其进行紫外分光扫描，比较其图谱，分析其连接效果。1.2.4 考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度 取6支试管，按下表数据配制01000l/mL 牛血清白蛋白溶液各1mL 管 号试 剂1234561000l/mL牛血清白蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20蛋白质浓度（l/mL）02004006008001000 准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，作出标准曲线。 将合成的抗原稀释到一定浓度后按上法与考马斯亮蓝溶液反应，测定其OD值，并将测定的OD值代入标准曲线中以求出合成抗原中蛋白质的浓度。1.2.5 抗体的制备1.2.5.1 佐剂和免疫抗原的混合 将人工抗原慢慢解冻，根据完全抗原的实际浓度取出一定量，使其溶液中至少含有蛋白质100g，然后加入等量的弗氏佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂），混合物在旋涡混合器上充分振荡混合至W/O状态。1.2.5.2 动物实验 选择两只健康的Balb/c小白鼠（一只免疫青霉素，一只免疫氨苄青霉素），做好标记后饲养于动物房中，并按下表对小白鼠进行药物免疫。免疫次数免疫时间免疫原免疫剂量免疫部位1免疫抗原和等量弗氏完全佐剂混合100g蛋白质腹部、腿部肌肉2第1次免疫后两周免疫抗原和等量弗氏不完全佐剂混合100g蛋白质腹部、腿部肌肉3第2次免疫后18天同上100g蛋白质腹部4第3次免疫后三周同上100g蛋白质腹部5第4次免疫后三周同上100g蛋白质腹部1.2.5.3 血清的制备用70的酒精对剪刀和镊子进行消毒，同时用沾了酒精的棉花球对小白鼠的尾部末端进行消毒，用消了毒的剪刀剪下小白鼠尾部的末端，然后用4mL的离心管进行采血，采血后马上进行离心处理，然后把离心后的血液放置在4冰箱中静置3个小时，取上层血清分装保存于20冰箱中。1.2.6 ELISA法检测抗体的抑制性抗生素间接竞争ELISA法的原理：将抗生素分子和大分子载体蛋白质偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测抗生素和相应的抗体，固相载体上的抗生素就和待测抗生素竞争与血清中的抗体反应。待测抗生素含量高，则被结合在固相抗原上的抗体就少，反之，结合在固相抗原上的抗体就多。反应后加入酶标二抗，最后通过底物显色测定OD值。当抗体的量一定时，加入的待测抗生素量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高。反之，发色反应增强，抑制率降低。1.2.6.1 包被抗原（1）分别取一定量的氨苄青霉素OVA和氨苄青霉素OVA，用包被液稀释成0.5、1.0、2.0、4.0l/ml 四个浓度。（2）将稀释后的抗原溶液以100l/孔加入到酶标板上，4冰箱中放置过夜。（3）取出，甩干，用PBST洗涤液洗3次，拍干（4）加入封闭液200l/孔，水浴中放置3h，甩干后用蒸馏水洗涤3次，然后放置于烘箱中2h。1.2.6.2 抗血清药效的测定（1）根据配制药物稀释液。（2）将动物血清稀释500倍。（3）先在一块空板（未经包被，用蒸馏水洗涤一次，甩干）里依次加入75l 原药标液，再在每孔均加入75l 经稀释（倍比稀释）的血清，37温箱中孵育1h，让原药与血清先在空板上充分反应。（4）把空板中的液体转移到包被板上，37温箱中孵育1h。（5）蒸馏水洗涤3次，甩干，加入酶标二抗（1：6000），37温箱中孵育1h。（6）蒸馏水洗涤3次，甩干，加显示液，37温箱中显色15min，加入终止液。（7）酶标仪测定OD值。2 实验结果与分析2.1 免疫抗原紫外分光扫描图1 青霉素、青霉素BSA、BSA的紫外图谱青霉素青霉素BSA BSA （2）氨苄青霉素的扫描结果图2 氨苄青霉素、氨苄青霉素BSA、BSA紫外图谱氨苄青霉素氨苄青霉素BSABSA从紫外扫描图谱可以看出，合成的完全抗原的图谱与载体蛋白、半抗原的图谱都有所不同，同时，完全抗原最大吸收峰波长与载体蛋白、半抗原的比较也不同，这说明合成的产物是不同于载体蛋白和半抗原的物质，也就是载体蛋白和半抗原的复合物。从图谱上可以看出，氨苄青霉素BSA的图谱与其它两个图谱差异较大，这说明氨苄青霉素与BSA偶联得比较彻底。而青霉素与BSA也有偶联，但总体上不如氨苄明显。2.2 考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度根据图3，可以计算出各种合成抗原的浓度：青霉素BSA的OD值为0.730，则其蛋白质浓度为845.889g/mL氨苄青霉素BSA的OD值为0.739，则其蛋白质浓度为855.889g/mL青霉素OVA的OD值为0.709，则其蛋白质浓度为822.556g/mL氨苄青霉素OVA的OD值为0.452，则其蛋白质浓度为537.000g/mL2.3 ELISA法检测抗体的抑制性2.3.1 氨苄血清检测2.3.1.1 检测1mg/ml的药物（用2g/ml的包被浓度）表1 氨苄血清检测结果（1mg/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（1mg/ml）0.5590.2030.1320.0980.0780.0600.061不加药物0.6050.2800.2240.1250.0910.0770.0722.3.1.2 检测10g/ml的药物（用2g/ml的包被浓度）表2 氨苄血清检测结果（10ug/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（10ug/ml）2.1681.0380.8860.5190.4730.4740.319不加药物2.0891.5481.2270.6870.6310.5530.351阴性血清0.4320.4110.3960.3890.4110.3740.3962.3.1.3 检测1g/ml的药物（用2g/ml的包被浓度）表2 氨苄血清检测结果（1ug/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（1ug/ml）0.6570.5120.2770.1810.1270.0880.074不加药物0.8080.4900.3170.2470.1320.0890.074阴性血清0.0680.0620.0520.0480.0510.0470.047 从氨苄血清检测的表和图可以看出，1mg/ml的药物和10g/ml的药物对抗血清的抑制性比较好，而就1g/ml的药物虽然也有抑制，但不明显。即用制备的抗体可以检测的到氨苄青霉素的浓度可以达到10g/ml左右，而到达到1g/ml则需进一步探讨。2.3.2 青霉素血清检测2.3.2.1 检测1mg/ml的药物（用2g/ml的包被浓度）表4 青霉素血清检测结果（1mg/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（1mg/ml）0.2130.1080.0790.0640.1440.0640.065不加药物0.4240.1880.1240.1210.0680.0730.0562.3.2.2 检测10g/ml的药物（用2g/ml的包被浓度）表5 青霉素血清检测结果（10ug/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（10ug/ml）2.1301.8711.5921.2660.9890.7800.661不加药物2.1941.9201.7191.3600.9850.8250.676阴性血清0.2050.2380.2160.1960.1940.2040.1932.3.2.3 检测1g/ml的药物（用2g/ml的包被浓度）表6 氨苄血清检测结果（1ug/ml）血清稀释倍数50010002000400080001600032000加药物（1ug/ml）1.9361.7691.4991.1290.9500.6580.481不加药物2.0031.7531.5171.1920.9550.6290.429阴性血清0.2310.2210.3140.2510.2830.2060.215从青霉素血清检测的表和图可以看出， 1mg/ml的药物对抗血清的抑制性很明显，但10g/ml的药物的抑制效果则不是很明显，而1g/ml的药物对抗血清则基本没有抑制，所以，抗血清可以检测的到青霉素的浓度基本上可以达到10g/ml，但很难达到1g/ml。3 总结 综观整个实验的过程和一年来实验的经历，得出以下几点体会：（1）实验的目的明确，意义较大，对抗生素快速检测技术的发展有一定的推动作用，也可以填补快速检测内酰胺类抗生素的空白，但同时，该实验对实验者的操作技能和对理论知识的理解能力也有很大的要求，要将理论知识与实验相互结合才能顺利地完成实验目标。（2）实验期间，最好能有连续的时间段进行实验，能及时对实验方法和实验中出现的问题进行改进和解决，