环境微生物学教学课件13-2生长量测定方法

细菌生长（数量）测定方法,（一）直接计数法（测微生物总数）,借助显微镜观察测定,优点：快速提问:有哪些缺点?缺点：不能区分细菌的死活分四种,1.涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.01ml1cm2)*视野面积(cm2),2.计数器(血球计数板）测定法,0.1ml菌液,提问：数了125个小格中有90个细菌，样品中的细菌浓度是多少？(90个125)*400/0.1ml=2880个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体若太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数细菌（或其他微生物或细胞）数目，（一般数125个小格），折算样品细菌浓度；,3.比例计数法,比例样品菌液与等体积的血液混合，观测二者比例,提问：如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，则细菌数量=？5.5400万个/ml=2.2107个/mL样品,红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，平均400万个/ml,4比浊计数法,浊细菌悬浮液的浊度,提问：如何定量二者关系呢？,细菌不完全透光，一定范围内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,（1）制标准曲线（ODNo）,（2）测菌液浊度，查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光光度仪,（二）间接计数法(测定活菌数),提问：前述方法中计数的不都是活菌，如何分辨菌死活？繁殖提问：细菌繁殖的可见现象是什么？产生菌落（固体培养基培养）、菌液混浊（液体培养基培养）计数原理：一个细菌可繁殖成一个菌落或一群细菌.缺点：慢分固体培养法和液体培养法,无菌水,1.稀释平板计数法固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度（10-x）菌液,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第四步：计数,细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释度例如：10-5稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌菌落总数（CFUColonyFormingUnit）的测定。注意：作空白及取平行样（23组）均值减小误差,平均,2.稀释液体计数法,特点：液体培养、统计学查表计数又称MPN法（或最可能数法）MostProbableNumber例如测定SRB（硫酸盐还原菌，厌氧）的数量提问：能用稀释平板法计数吗？为什么？一般不能，厌氧菌暴露在空气中不能生长（除非厌氧培养箱）,对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行深层隔氧液体培养，按MPN法进行计数。,（1）稀释,（2）稀释接种样品,在液体表面加一层无菌液体石蜡隔绝氧气，,恒温37培养14天,记录变黑的试管情况,（3）培养,1ml,+9ml,培养基,提问：为什么有些试管变黑有些没有？,稀释程度、取样概率,(4)统计查表计算,根据不同稀释度变黑试管统计出数量指标三位数及其中最低稀释度（取变黑的管数最多、稀释度又最低的生长管数，为第一位数字，后面两个稀释度的生长管数为后两位数）提问：上例情况而言统计数量是几？,查表表MPN表,32010-4,MPN三管法测数统计表,水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。,个菌/毫升,细菌最可能数通过其他精确的计数法，确定的各种数量指标时细菌数量的最可能值,上面例子中数量指标“320”对应的细菌最可能数为9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为？个菌/毫升。,3.薄膜计数法,薄膜微孔滤膜（0.45um）,（2）滤膜培养,膜有菌面冲上,原理膜抽滤（细菌浓缩）+膜平板培养+计数,（3）统计计数提问：假如测出250个菌落，抽滤了50ml自来水，自来水中菌浓度是多少呢？25050ml=5个/ml自来水样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数,要求样品洁净如空气或饮用水。？堵孔、菌太多难以分散,提问：如何用活菌计数法测定较脏的水样？减少滤液体积、无菌水稀释,(三)重量法（测细胞的质量）,提问：已知什么条件通过测定细菌群体重量知道其数量？已知单个细菌的平均重量除法计算细菌的湿重量10-1510-11g/个细胞干重约为湿重的1020。,1.干重法,方法：含菌水样在105110下进行干燥恒重（本质测水中悬浮物重量MLSS或MLVSS）。,2.细胞含N量法,3.DNA含量法,4.其它生理生化指标法,MixedLiquorSuspendedSolids,MixedLiquorVolatileSuspendedSolids,悬浮物无机物+有机物（包括细菌）提问：如何确定悬浮物中有机物与无机物的量？高温(550)灼烧,无机物化学性质稳定，高温下不会分解提问：什么情况下可以直接用悬浮物的重量表示细菌的重量？悬浮物中绝大多数是细菌。,干重法,（1）悬浮物中绝大多数为细菌时,细胞数目=MLSS个体细菌的平均干重量,恒重,或,MLSS悬浮物,（2）除细菌外还有大量无机悬浮物时,W无MLVSS挥发性悬浮物MLSSW无=细菌群体的干重量细胞数目=MLVSS个体细菌的平均干重量,2h,MLSS,（3）有大量非细菌有机悬浮物时,提问：如何测定呢？不