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文档简介

小鼠肝组织RNA提取及RT-PCR,一、试剂及材料,1、小鼠肝脏2、DEPC处理过的EP管、PCR管3、Trizol、氯仿、异丙醇、DEPC水,二、实验原理,TRIZOL：异硫氰酸胍+苯酚,裂解细胞，RNA与蛋白质分离，将RNA释放到溶液中。,促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层。,RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。,三、实验步骤,RNA提取1、新鲜肝组织置EP管中，加200lTrizol充分研磨后，补加800lTrizol，枪头吹匀。2、加入200l氯仿，剧烈震荡15秒，412000g离心15min。3、将上层水相移至洁净EP管中，加入500l异丙醇颠倒混匀。4、412000g离心10min。5、弃水相，EP管开盖干燥，溶于50lDEPC水中。,RT-PCR：RNA的反转录+cDNA的PCR,RT-PCR操作步骤,5xPrimeScriptBuffer2lPrimeScriptRTEnzymeMix0.5lOligodTprimer(50m)0.5lRandom6mers(100m)1l提取的RNA0.5lRNaseFree水5.5l3715min855sec,10l,PCR10 xPCRBuffer5ldNTP4l模板DNA2l引物12l引物22lTag酶0.5lH2O34.5l,50l,945min9430sec5430sec7230sec727min,25cycle,20ul样本4ull
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