聚合酶链式反应原理

聚合酶链式反应技术PolymeraseChainReaction,常立功2014-09-29,-学术活动-,PCR的起源与发展PCR基本原理普通PCR过程与分析荧光定量PCR过程与分析,-学术活动-,PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成单股，等温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中，以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理由。,-学术活动-,1953年，DNA被发现是细胞里携带遗传信息的分子。1956年，第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶（此时的基因扩增仅在实验室，小规模的扩增，操作繁复，成本高）。1973年，台湾人钱嘉韵在黄石公园里热泉中发现的嗜热菌中并分离出耐热的Taq聚合酶。1984年，美国人K.Mullis(穆里斯)和日本人才木共同奠定了现代PCR技术的基础，使PCR技术进入普通实验室，前者在1993年获得诺贝尔化学奖,-学术活动-,现代实验室大多使用RT-PCR技术检测某个基因的表达。逆转录（ReverseTranscriptionRT）是将RNA转录成cDNA的过程。为什么要进行逆转录？为什么要提取RNA而非DNA？,-学术活动-,逆转录示意图,-学术活动-,逆转录体系,-学术活动-,1.Oligo(dT)18：能与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，适合真核生物mRNA的转录,尤其是新鲜的组织或细胞，当所提取的RNA片段长度小于2kb,无复杂三级结构随机六聚体引物：适用于mRNA内含抑制反转录酶活性的终止序列，适合提取无Poly(A)尾巴的RNA、石蜡和破碎组织内提取的RNA，特别是当提取片段超过2kb，内部有复杂的三级结构的，特异性引物：用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,逆转录引物区别,-学术活动-,普通PCR反应体系,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应组分,变性,普通PCR示意图,延伸,重复,退火,循环2X2个拷贝,循环3X3个拷贝,-学术活动-,PCR反应模式,-学术活动-,普通PCR结果分析,-学术活动-,荧光定量PCR,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应组分,变性,荧光染料法原理,SYBRGreenI,l,延伸,检测激发的荧光,退火,d.NTPs,Taq酶,Primers,反应体系,变性,l,TaqMan探针原理,退火,1.链取代,2.水解,3.聚合,4.检测荧光,l,-学术活动-,标准曲线分析法,-学术活动-,标准曲线分析法,-学术活动-,无需制备标准品(2-c(t)法)，但需要内参照基因，且要求内参与目的基因扩增效率相近。内参Ct值=15-