胃蛋白酶在二甲基亚砜中的催化机理研究

胃蛋白酶在二甲基亚砜中的催化机理研究李利佳，郭诗静，黄卓烈（华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642）摘 要： 本实验以固定浓度酪蛋白为底物，研究二甲基亚砜对胃蛋白酶催化活性的影响。中、低浓度的二甲基亚砜对胃蛋白酶有激活作用，高浓度则表现为抑制作用，并使胃蛋白酶的热稳定性下降。胃蛋白酶在二甲基亚砜中随温度的升高先被激活，然后被抑制。研究胃蛋白酶的催化动力学发现Km值和Vmax值与在缓冲液中相比均发生了不同程度的变化。胃蛋白酶在有机溶剂作用下的紫外吸收光谱、紫外差示光谱、荧光发射光谱表明胃蛋白酶在二甲基亚砜体系中构型和构象都发生了不同程度的改变。关 键 词：二甲基亚砜 胃蛋白酶 酶活性 动力学 光谱分析 构象中图分类号： 文献标识码：6传统的观点认为酶作为一种高效的催化剂，只有在水溶液中才可发挥其催化作用，而在有机溶剂中会发生构型变化而失活。直到上一世纪六十年代才发现几种酶在有机溶剂中仍有活性1,2。八十年代Klibanov等3，4相继发现某些酶在近乎无水的环境下仍有催化活力，并且稳定性还有提高。至此，非水酶学才真正发展起来。近来，Clark和同事对枯草杆菌蛋白酶的研究又发现有机溶剂能极大地增大酶活5,6。作为非传统的介质，有机溶剂不仅可以介导酶促反应，而且因为其种类多，理化性质选择余地大，容易操作，且酶在其中比在水中更稳定又不易受污染等特点而具有众多无可比拟的优越性。胃蛋白酶（pepsin）是一种单链酶，分子量为35500，在pH1.55.0条件下，胃蛋白酶原变成小分子的胃蛋白酶。胃蛋白酶在胃中很酸的环境下消化蛋白质，它催化具有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等肽键的断裂，使大分子的蛋白质变为较小分子的多肽。pH超过6以上即失去活性，胃蛋白酶在pH2时优先作用于天然蛋白质。pH4时能消化某些特异性的肽。在体外，胃蛋白酶的持续作用可使蛋白分子的肽键约有30%分裂，形成脙、胨和一些氨基酸，而且一部分被分解为酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。近年，国内外关于有机溶剂对胃蛋白酶的催化作用影响的研究还没有系统的报道。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂胃蛋白酶（pepsin）（厦门星隆达(Sanland)化学试剂有限公司）；酪蛋白（Sigma）；考马斯亮蓝G-250；Sephadex-G100、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亚砜、浓盐酸、氢氧化钠、氯化钠、乙酸、乙酸钠、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、乙二胺四乙酸（EDTA）、甘氨酸、酪氨酸等1.1.2 仪器HWS24型电热恒温水浴锅（上海益恒实验仪器有限公司）；752型紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；Centrifuge 5810R型 Elpendorf冷冻高速离心机（德国）；PHS-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）；vivascience vivaflow50型超滤系统（德国）；DYY-5型稳压稳流电泳仪及DYCZ-23A型电泳槽（北京六一仪器厂）；DBS-160型电脑全自动样品部分收集器（上海沪西分析仪器厂）；UV-240pc型紫外分光光度计（日本岛津）；F-4500型荧光分光光度计（日本日立）。凝胶成像系统（珠海黑马医学仪器有限公司）1.2 方法1.2.1 胃蛋白酶溶液的制备取胃蛋白酶适量，用0.065M的盐酸溶液溶解（1mg胃蛋白酶/ml盐酸溶液）1.2.2 蛋白质含量的测定参照Bradford71.2.3 胃蛋白酶活性测定方法参考中国药典（2000） 胃蛋白酶活力单位（U）定义：在pH1.5和37下保温5min，蛋白酶水解已保温1%的酪蛋白每分钟产生1ug酪氨酸的酶的毫克数为一个胃蛋白酶活力单位。胃蛋白酶活性的计算公式：每克胃蛋白酶活力=AWsnAsWT181.19式中字母含义：As：测定的酪氨酸溶液的平均吸收度 A ：测定酶反应体系的吸光度Ws：酪氨酸溶液每1ml中含酪氨酸的量（ug） W ：胃蛋白酶的取样量(g) T ：反应时间（min） n ：胃蛋白酶液的稀释倍数 181.19 ：酪氨酸的分子量 1.2.4不同浓度二甲基亚砜对胃蛋白酶的影响测定在37、反应体系相同的条件下，研究不同浓度的二甲基亚砜中胃蛋白酶的活性变化，浓度设置：0%、1%、2%、4%、5%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、16%、32%、41.7%1.2.5 二甲基亚砜中胃蛋白酶温度活性曲线测定 0.065M盐酸溶液的反应体系温度设定为： 35、37、40、45、50、54、55、 56、57、59、60、659%二甲基亚砜溶液的反应体系温度设定为：30、35、37、40、45、50、55、56、57、58、59、60、651.3.6 胃蛋白酶的纯化方参考于成国等8、肖志坚等9、现代化学试剂手册的方法1.3.7纯化后的胃蛋白酶的电泳测定参考郭尧君10编著的蛋白质电泳实验技术浓缩胶的浓度为5%，分离胶的浓度为7.5%，点样量为15L/孔。浓缩胶电泳的电压为100V，分离胶电泳电压为200V。电泳后用考马斯亮蓝R-250染色30min后脱色。1.3.8 有机溶剂中胃蛋白酶的动力学测定参考余冰宾11等研究酶动力学和动力学参数的方法1.3.9紫外差示光谱的测定将所得有机溶剂中酶的紫外吸收光谱的数据减去0.065M盐酸溶液中胃蛋白酶紫外吸收光谱的数据，得到胃蛋白酶的紫外差示光谱。1.3.10荧光发射光谱的测定2 结果与分析2.1不同浓度二甲基亚砜对酶活性的影响 由图3.1可见当二甲基亚砜的浓度小于22%时，酶活升高，9%的浓度是其最大激活浓度，其酶活力与对照相比增大83.4%。浓度高于9%时，酶活力随着浓度的增大而降低，22%的浓度开始表现为抑制。2.2.2 二甲基亚砜中温度对胃蛋白酶活性的影响由图3.5可见,胃蛋白酶在缓冲溶液中,其最适温度为57，此时，酶活力比37时增大3.1倍。低于57时，酶活力随着温度的升高而增大，超过60，酶活力迅速下降。由图3.6可知，9%二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶水解酪蛋白的最适温度与在缓冲液中一样，为57。在低于和高于57的反应体系中，酶活力随着温度的升高而剧烈变化，前者随着温度的上升，酶活力迅速上升，后者随着温度的上升，酶活力迅速下降。低于58时，二甲基亚砜对胃蛋白酶有激活作用，而高于此温度时，却表现为抑制作用。 2.3 胃蛋白酶的纯化与鉴定酶活性检测后，发现酶的最高活力峰与第二个蛋白峰重叠（图3.10），经分离纯化，酶的比活力比粗酶活力提高了2.67倍。将分离纯化后的酶进行PAGE电泳，电泳图谱（图3.11）显示，粗酶经分离纯化得到的胃蛋白酶电泳仅剩下一条和商品纯酶迁移率一样的电泳带。说明本实验对粗酶的纯化已经达到电泳纯。用考马斯亮蓝G-250测定纯酶液的蛋白质含量，测定结果为28.3ug/ml。 1 2 3 （1-粗酶，2-纯化后的酶，3-商品纯酶）图3.11胃蛋白酶PAGE电泳图谱2.4 二甲基亚砜中胃蛋白酶的动力学研究 2.4.1 在缓冲液中胃蛋白酶的动力学测定在缓冲液中胃蛋白酶的动力学曲线见图3.12。根据双倒数作图法求出天然胃蛋白酶的Km=2.22mg/ml，Vmax=1.1106U/mg Pro。2.4.2 9%二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶的动力学 在 9%二甲基亚砜中胃蛋白酶的动力学曲线见图3.13。根据双倒数作图法求出9%二甲基亚砜中胃蛋白酶的Km=1.5mg/ml，Vmax=0.5106U/mg Pro。2.5.1 二甲基亚砜中胃蛋白酶紫外吸收光谱的研究2.5.1.1 0.065M盐酸溶液中胃蛋白酶的紫外吸收光谱 从图3.17可以看出，缓冲液即0.065M盐酸溶液中的胃蛋白酶的紫外吸收光谱中有两个明显的吸收峰，其中270280nm处的吸收峰是酪氨酸的特征吸收峰，最大吸收值在276nm处为0.135，；在有一较大的吸收峰，204nm处的最大吸收值为2.621。Abs200.0250.0300.0350.0400.00.0001.0002.0003.0000.000Wavelength (nm) 图3.17 0.065M盐酸溶液中胃蛋白酶的紫外吸收光谱2.5.1.2 9%的二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶的紫外吸收光谱荧光强度从图3.18可以看出， 9%的二甲基亚砜中的胃蛋白酶在236242nm和275280nm处有两个明显的吸收峰，而且在200235nm有很多小峰，取代了202206nm处的吸收峰。在275280nm处保留了酪氨酸的特征吸收峰，其最大吸收值为0.165，最大吸收值增加了22.2%。从该光谱图推测二甲基亚砜中的胃蛋白酶的分子结构应该发生较大的变化。Abs200.0250.0300.0350.0400.00.0001.0002.0003.0000.000 9% 0 9图3.18 9的二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶的紫外吸收光谱Wavelength (nm)2.5.2 有机溶剂中胃蛋白酶紫外差示光谱的研究2.5.2.1 9%二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶的紫外差示光谱从图3.22可以看出，经9%的二甲基亚砜溶液处理的胃蛋白酶的紫外差示光谱出现了明显的负吸收峰和正吸收峰。202.0206.0nm附近有一个明显的负吸收峰，最大吸收值为-2.519。负吸收一直延伸到236.0nm出，自237.0nm开始为正吸收。237.0240.0nm有一个较小的正吸收峰，最大峰值为0.194。正吸收延伸到303.0nm处基本消失。这说明9%的二甲基亚砜溶液能使酶分子的构象发生变化，使其趋向有利于催化反应的方向进行，对该酶起激活作用。 AbsWavelength (nm)200.0250.0300.0350.0400.00.0001.0000.000-1.000-2.000-3.000 0 9图3.22 9%二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶的紫外差示光谱 3.5.3.2 9%的二甲基亚砜溶液中胃蛋白酶的荧光发射光谱从图3.27可以看出，胃蛋白酶经9%的二甲基亚砜溶液处理后，其荧光发射峰与缓冲液中的胃蛋白酶相比，峰位蓝移一个单位。最强的荧光强度为1381，位于338.4nm处，比天然酶的最强荧光强度提高12.09%。 图3.26 0.065M盐酸溶液中胃蛋白酶的荧光发射光谱3 讨论4.1 二甲基亚砜对胃蛋白酶催化活性的影响研究发现，二甲基亚砜对胃蛋白酶表现出中低浓度激活，高浓度抑制的效果。有机溶剂中酶的结构和活力与溶剂的性质有一定相关性。二甲基亚砜的极性小于水，纯水体系中加入了二甲基亚砜，体系的极性降低。体系的极性降低，使得水系统局部能量降低，有利于水集团的拆散，单体水分子数目增加，这有利于蛋白质对水分子的结合，使酶分子表面吸附的水分子数目增多，酶分子的柔性增大，酶与底物间形成过渡态的能阀更小，使酶活力升高。4.2 温度对有机溶剂中胃蛋白酶催化活性的影响温度是通过增加底物和酶分子的热能、加快反应速率以及导致酶的变性等方面共同作用来影响酶的催化活性的。当温度升高，反应速率加快；但随温度升高，酶蛋白逐渐变性而失活，引起酶反应速率下降。酶所表现的最适温度至少应是这两种影响的综合结果。胃蛋白酶在二甲基亚砜中随温度的升高先被激活，然后被抑制，可能是随着温度的升高，开始以增加底物和酶分子的热能、加快反应速率的作用为主，但随温度继续升高，以酶蛋白逐渐变性而失活的作用为主，所以都表现为先被稍微激活，后被抑制。4.3 有机溶剂中胃蛋白酶的动力学探讨研究发现，胃蛋白酶在一定浓度的二甲基亚砜的Vmax和Km与对照相比均变小。按照经典动力学分析，可推断常温下，这些有机溶剂对酶的影响类似于反竞争性抑制。有机溶剂对酶催化作用的影响，主要应该是通过“微调”反应体系中的极性。二甲基亚砜的极性比水低，有可能中和了酶分子极性侧链基团之间的偶极相互作用，也可能使水系统的内聚能减少，使得酶分子表面吸附的水分子数增多。两种情况都使得酶分子的柔性增大，酶与底物间形成过渡态得能阀更小，从而增大了酶与底物的亲和力。但体系中极性的改变，也改变了催化中心的为环境，使最大反应速度下降。二甲基亚砜可能由于增大酶与底物的亲和力贡献比较大，所以表现为表观激活。4.4 光谱分析4.4.1 紫外吸收光谱分析一般地，蛋白质的紫外吸收光谱在270280nm及200230nm两处各有一个吸收峰。250nm左右是低谷。其中270280nm的峰是酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）的侧链所提供；200235nm是肽链的肽键的吸收。本研究发现，天然胃蛋白酶的紫外吸收光谱在204.0nm和275.0nm处各有一个吸收峰。经9%的二甲基亚砜溶液处理后，酶分子的吸收发生很大的变化。二甲基亚砜的加入，可能打断了酶分子的某些二硫键，或使某些深埋的半胱氨酸（Cys）暴露出来了，导致了酶分子二级、三级结构等高级结构和非共价键的部分破坏，使肽键所处的环境发生了较大的变化，这种变化显得比Trp和Tyr残基更敏感21。由于Cys在235nm附近有吸收12，从而在238.0nm附近产生了紫外吸收峰。由于二甲基亚砜在215nm233nm有较大的吸收（最高峰值在226nm），所以在扣除参比液后，在这一波段产生噪音，因此不能分析该波段经二甲基亚砜处理的胃蛋白酶的紫外吸收光谱13。4.4.2 紫外差示光谱分析紫外差示光谱的变化能进一步反映酶在有机溶剂中与Tyr及Trp残基有关的构象变化。胃蛋白酶在二甲基亚砜中，200.0nm236.0nm为负吸收。由已知研究可知，其中，200.0nm220.0nm的负吸收应该由肽链骨架由无规则卷曲变成a-螺旋所引起，220.0nm236.0nm的负吸收则可能与酶分子主链的去折叠有关14。237.0nm240.0nm出现的微小正吸收可能与主链的构象变化相关15。所以，二甲基亚砜对胃蛋白酶的激活作用应该是通过改变酶分子的主链构象，使酶与底物的结合变得更加容易。4.4.3 荧光发射光谱分析蛋白质分子中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)具有荧光性质(其相对荧光强度为10090.5)，此蛋白质内源荧光可作为探针检测蛋白质构象变化。278nm波长光激发时,蛋白质分子中的Tyr和Trp残基受到激发，295nm波长光只激发蛋白质分子中的Trp残基，所产生荧光的强度和位置与这些残基所处的微环境密切相关。如果蛋白中不含Trp，只含Phe和Tyr(称为A类蛋白质)，则荧光光谱主要表现Tyr的特征,最大发射波长约为304.0nm。对于含有Trp的蛋白(称为B类蛋白质)，荧光光谱则主要表现Trp的特征,最大荧光发射在310.0-350.0nm之间。处于蛋白质分子表面的Trp残基具有350.0-353.0nm的荧光发射峰,而包埋于蛋白质内部Trp残基的荧光发射峰在326.0-332.0nm之间，处于非极性环境Trp残基的荧光发射峰在310.0-324.0nm附近16,17。用280.0nm波长激发光激发时，天然胃蛋白酶的荧光发射光谱中，最大发射峰在340.0nm附近,说明胃蛋白酶荧光主要来源于Trp残基，且部分Trp处于分子表面,部分包埋于蛋白质分子内部。通常，极性的增强往往使*跃迁的能量降低,从而使荧光增强18。然而，没有溶剂极性性质的胃蛋白酶，在二甲基亚砜中，荧光强度却有不同程度的增强。这可能是由于酶分子表面的Trp在加入有机溶剂后，改变了酶分子环境的介电常数，从而改变了分子内部Tyr、Trp残基的微环境，致使处于淬灭状态的Tyr荧光得以恢复；也可能是由于Trp与Tyr之间的能量传递降低，从而使荧光强度增强。5.2 展望本实验探讨了二甲基亚砜对胃蛋白酶催化活性的影响关系，并运用紫外吸收光谱、紫外差示光谱、荧光发射光谱等光谱技术分析了胃蛋白酶在几种有机溶剂中空间构象的变化。但对于胃蛋白酶在有机溶剂催化活性变化的研究，在很多方面仍有待作进一步深入研究： 1、比较有机溶剂中不同的底物，对胃蛋白酶催化活性的影响，进一步探讨有机相酶催化中底物对酶的催化活性的影响。2、 采用不同的有机介质体系研究胃蛋白酶催化活性的变化。3、 比较同种有机溶剂对不同酶的催化活性影响的研究。参考文献：1 DastoliF.R. ，Musto N. A. and Price S. Arch. Biochem. Biophys. 1966;115:44-2 DastoliF.R. and Price S. Arch. Biochem. Biophys. 1967;188:163-3 Zaks A. and Klibanov A.M. Science 1984;224:1249-4 Zaks A. and Klibanov A.M. J. Biol. Chem.1988;263:8017-5 Ru MT, Hirokane SY, Lo AS, et al. On the salt-induced activation of lyophilized enzyme activity. Am Chem Soc, 2000,122:1565-15716 Ru MT, Wu KC, Lindsay JP, et al. Towards more active biocatalysts in organic media: increasing the activity of salt-activated enzymes.Bioeng, 2001,75:187-1967赵亚华.生物化学实验技术教程. 广州.华南理工大学出版社.2000:40418于成国等.人胃蛋白酶原I、II的分离纯化.中国医科大学学报. 2000.29 (6)：4104149肖志坚等.1996.67ku胃蛋白酶原的分离纯化及性质研究.生物化学与生物物理进展.23(4).34234510郭尧君.蛋白质电泳实验技术.北京.科学出版社. 1999:p566911余冰宾.生物化学实验指导（第一版）.北京.清华大学出版社2004: p187190 12鲁子贤.蛋白质化学.北京:科学出版社. 1981：949813李明珠.几种有机溶剂对酵母蔗糖酶催化活性的影响研究.华南农业大学硕士学位论文:8914陈清西，周兴旺，杨佩真.乙二醇对长毛对虾酸性磷酸酶活力与构象的影响.台湾海峡. 1999. 18（4）:39840115陈清西,颜思旭等.1991.菠萝果蛋白酶的分子构象与活力变化的研究.生物化学杂志.7(3):30130716喻东,黄新河.秋水仙碱与胃蛋白酶相互作用的光谱性质研究.化学研究与应用.2005 17(4)：47447617 Lakowica J R. Principle of Fluorescence Spectroscopy. New York. Plenum Press,1983:341-381.18郭德济等.光谱分析法（第二版）重庆：重庆大学出版社.2001：168169 Effect of Dimethylsulfoxide on Catalytic Activity of PepsinLijia Li, Shijing Guo, Zhuol