冰片修饰的丹参酮固体脂质纳米粒胶囊设计

冰片修饰的丹参酮固体脂质纳米粒胶囊设计专业中药制药姓名王巧莹学录前言11丹参酮的药理作用211抗肿瘤作用212抗菌消炎作用213保护皮肤214抗脂质过氧化和清除自由基作用215对消化系统的作用316对中枢神经系统的作用317改善外周循环318调节组织修复与再生32丹参酮的临床应用321感染性疾病322辅助治疗恶性肿瘤423治疗心脑血管疾病43冰片概况44固体脂质纳米粒概况55立题依据5第一章提取分离工艺611预实验6111提取工艺的确定6112色谱条件的确定7113系统适用性检查812提取工艺的研究9121提取溶剂的选择9122料液比的选择10123提取时间的选择10124提取次数的选择1013分离工艺的研究11131薄板的制备11132洗脱剂的选择11133装柱11134样品的处理及上样11135洗脱及收集样品11第二章固体脂质纳米粒制备研究1321固体脂质纳米粒的制备方法13211高剪切乳匀和超声分散13212高压乳匀法13213乳化蒸发法14214微乳法1422固体脂质纳米粒的干燥方法15221冷冻干燥法15222喷雾干燥1623空白固体脂质纳米粒制备方法的筛选16231溶剂乳化法17232熔化匀化法17233熔化超声分散法17234薄膜超声分散法17235乳化蒸发低温固化法1724冰片修饰的丹参酮IIA固体脂质纳米粒的制备18第三章固体脂质纳米粒的质量评价1931外观及稳定性观察1932形态以及粒径分布1933包封率的测定1934物相分析1935体外释药实验2036体内实验20第四章口服冰片修饰的丹参酮IIA固体脂质纳米粒剂型研究2141固体脂质纳米粒的给药方式21411注射给药21412口服给药21413透皮吸收21414肺部给药2242固体脂质纳米粒冻干粉的制备22421处方设计23422评价指标2343胶囊剂成型24第五章展望25参考文献261前言丹参为唇形科植物丹参（SALVIAMILTIORRHIZABGE）的干燥根及根茎，始载于神农本草经，被列为上品，是我国传统医学中常用的药材之一，有悠久的临床应用历史。丹参的功能与主治为。祛瘀止痛，活血通经，清心除烦。用于月经不调，经闭痛经，瘸瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛，说明丹参具有多方面的功效，中医有。一味丹参饮，功同四物汤。之说在中医临床上，丹参主要用来治疗冠心病、脑血栓和肝炎肝硬化等。常用的丹参类制剂包括丹参注射液、丹参片、复方丹参片、复方丹参滴丸等，以丹参的水提取物制各的丹参注射液在临床上广泛用于冠心病、心肌梗塞和脑血管疾病的治疗。丹参的化学成分主要分为水溶性和脂溶性两大类，20世纪早期的研究主要集中在以丹参酮为代表的脂溶性成分方面。丹参酮（TANSHINONE，TSN）是丹参中具有橙黄色和橙红色特征的脂溶性二萜类化合物，按其结构的不同可分为丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮I、羟基丹参酮、丹参酮甲酯、异丹参酮、异隐丹参酮等10多种成分，其中丹参酮IIA（TSNIIA）是丹参中脂溶性成分的代表（结构见下图）。由于醌类成分易被还原为二酚类衍生物，后者又被氧化而转变为醌，因此起到电子传递作用。它们作为生物体内新陈代谢的产物，通过促进或干扰生物的多种生化反应，从而表现出多种生物活性。丹参酮IIA还具有天然抗氧化作用，大量的研究表明丹参酮在抗肿瘤、心脑血管疾病、抗菌消炎等方面均有良好的治疗作用。1丹参酮的药理作用211抗肿瘤作用丹参酮是丹参的主要抗肿瘤活性成分，通过各种肿瘤细胞杀伤、诱导分化及诱导凋亡等机制发挥抗肿瘤作用。诱导分化治疗恶性肿瘤与传统化学治疗的根本区别在于它不杀伤肿瘤细胞，而是诱导肿瘤细胞分化成为正常细胞或接近正常细胞，对正常细胞无杀伤作用，且少有骨髓抑制等副作用，其作用机制可能是通过抑制RAS癌基因和PCNA表达，影响DNA多糖酶活性，抑制DNA的合成，从而抑制细胞的大量增殖，诱导细胞分化。故丹参酮抗肿瘤作用可能是诱导肿瘤细胞分化，同时诱导凋亡或诱导肿瘤细胞分化成熟，最终走向凋亡。12抗菌消炎作用体外实验表明，隐丹参酮、二氢丹参酮等对葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌等致病菌有抑菌作用，尤其对耐药金黄色葡萄球菌有显著作用，并对两种毛发癣菌有抗菌作用，并且能抑制白细胞游走，抑制溶酶体释放，抑制中性粒细胞趋化性，影响巨噬细胞和成纤维细胞的功能，降低血中的前列腺素F2A（PGF2A）和前列腺素E1（PGE1）含量，减少炎症渗出。13保护皮肤丹参酮对痤疮丙酸杆菌高度敏感，且是一种缓和的雌激素样物质，起着抗雄激素的作用；还具有类似氢化可的松的抗炎作用。丹参乙醇提取物在高、中、低3个浓度均对蘑菇酪氨酸酶活性和黑色素生成量呈剂量依赖性激活和上调，表明丹参可提高白癜风疗效。丹参对痤疮的各种损害均有效。14抗脂质过氧化和清除自由基作用清除有害自由基，防止或减轻脂质过氧化反应，是丹参防治心、脑血管病、肝病、肾脏病的作用机制之一。丹参水提物、丹参注射液及丹参素、丹参酮A磺酸钠有清除超氧阴离子和羟自由基的作用。315对消化系统的作用丹参提取物F（DSEF）对大鼠胃黏膜再灌注损伤具有一定的保护作用。而且DSEF对胃黏膜体部损伤面积及深度损伤的抑制率高于窦部。16对中枢神经系统的作用丹参有明显的镇静作用，可使动物自发活动减少，大脑皮层自发电活动减少，并能延长环己烯巴比妥的睡眠时间。17改善外周循环中医认为丹参具活血化瘀之功效。现代医学研究表明，丹参有改善外周血液循环、提高机体的耐缺氧能力、加快微循环血液流通和增加毛细血管网等作用，并能抑制凝血、激活纤溶。进一步研究表明，丹参是通过影响脯氨酸和赖氨酸羟化酶的活性来抑制人体皮肤成纤维细胞合成胶原的，但不影响DNA及非胶原蛋白的合成，丹参对胶原合成的抑制率与剂量呈正相关。18调节组织修复与再生丹参制剂能使实验性心肌梗死狗坏死心肌清除加快，巨噬细胞活跃，成纤维细胞分化和胶原纤维形成较明显，肉芽形成较成熟，还可使骨折局部瘀血减轻，骨折愈合时间缩短。丹参还可抑制纤维细胞的过度增生，用于治疗硬皮病、瘢痕疙瘩等。2丹参酮的临床应用21感染性疾病外科一般化脓性感染中应用较多。丹参酮用于治疗金黄色葡萄球菌及白色葡萄球菌感染的骨髓炎有较好的疗效，对初发或感染较轻的病例疗效较显著。对病情较重、病程长，有窦道和死骨的病例配合外科手术效果好。长期服用丹4参酮未产生耐药性，对耐抗生素的金葡菌仍敏感。2丹参酮凡士林油膏外用，有抗菌、消肿、消炎作用，能促进伤口愈合。22辅助治疗恶性肿瘤丹参注射液联合化疗法具有协同、增效作用，用丹参注射液辅助治疗恶性肿瘤，能提高肿瘤细胞对化疗的敏感性，延迟肿瘤细胞对化疗药物的耐受性。同时可提高正常组织对化疗药物耐受性，并且对骨髓、心脏、消化道等重要器官有一定保护作用。23治疗心脑血管疾病丹参酮通过扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量供给心肌充足的氧，保护ATP酶的活性，纠正心肌细胞内异常的钙代谢，减少细胞内CA2超载，从而对心肌起到保护作用，对冠心病有很好的治疗效果。丹参酮能够扩张微动的小动脉，缓解血管痉挛，改善微循环，加快血流速度，从而改善心肌供血功能及减少心绞痛的发作，对于心绞痛有很好的治疗效果。另外，丹参酮可以扩张脑血管，增加脑血流量，提高纤溶活性，改善血流动力学，促进血肿吸收，减少脑组织兴奋性氨基酸的释放，降低应激性血糖升高而导致的脑出血。3冰片概况中药冰片，可分天然冰片和合成冰片两大类，天然冰片为脑香科植物龙脑香树脂的加工品，因资源紧缺，现多使用以樟脑、松节油等为原料的人工合成品，简称为冰片。中医认为冰片味辛苦，性凉，有开窍醒神、清热止痛、生肌之效，目前冰片在临床上的应用极为广泛，特别是在心脑血管疾病中的应用尤引人关注。冰片是一种单萜成分，在中药配伍中有广泛的应用。中医认为冰片。芳香走窜，引药上行。、。独行则势弱，佐使则有功。研究表明，冰片能加5速血脑屏障的开放，提高脑内药物分布，从而改善口服等给药途径的生物利用度。4固体脂质纳米粒概况固体脂质纳米粒（SOLIDLIPIDNANOPARTICLES，SLN）是指粒径在101000NM之间的固态胶体颗粒，它以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成固体胶粒给药系统，是20世纪90年代初发展起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合物纳米粒的新型胶体给药系统。其主要优点是颗粒粒径小，平均在纳米尺度，可用于注射给药；生理可接受，在制备过程中无有毒残留物；对亲脂性药物有足够的载药能力，通过工艺调整，还可以包封亲水性药物；延长药物释放达数日至数周；通过冷冻干燥或喷雾干燥还可制成固体粉末；通过对其表面进行特征修饰，可实现靶向给药；生理相容性好并可生物降解，可控制药物释放及有良好的靶向性，同时避免了有机溶剂不能完全去除的缺点。5立题依据丹参酮的水溶性差，生物利用度差，半衰期短，用药频率高，而心脑血管疾病需要长期用药，因此现有剂型病人的顺应性差。应用固体脂质纳米粒给药系统能很好的解决这些问题，也有文献报道，但很少。考虑到中药新剂型的研究要在中医理论指导下进行，中药间确实存在相互作用，已有的丹参方中冰片能够提高丹参的生物利用度，同时冰片还可以加速血脑屏障的开放，与固体脂质纳米粒协同作用，能提高脑靶向作用，更好地应用于脑出血等疾病。因此，本文设计了冰片修饰的丹参酮固体脂质纳米粒，以达到缓释、靶向的目的。6第一章提取分离工艺丹参酮是丹参中脂溶性化合物，为菲醒类化合物，包含有三十多种成分，丹参中的主要脂溶性有效成分包括丹参酮IIA、隐丹参酮和丹参酮I。由于丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I这三种成分在丹参植物中含量不低于2，而且它们的药理活性的比较显著，因此，研究这三种脂溶性的成分很具有代表性，在理论和应用上都很有意义。国内外的学者对丹参的提取分离以及结构测定进行了大量的研究工作。丹参酮的提取、分离方法比较多，主要是柱层析方法，包括氧化铝层析，分段切割法，硅胶柱层析配合制备型薄层分离法和多次柱层析，运用制备型高压液相分离法等。最理想的丹参酮提取分离方法应具备高效、环保、低毒、省溶媒、省时、节能等特点。11预实验111提取工艺的确定本实验利用加热回流法、超声波法和组织破碎法等三种提取方法同时提取丹参中脂溶性（丹参酮）成分，通过比较不同的提取方法对丹参提取物中丹参酮IIA含量测定的影响，确定丹参酮的提取工艺。1111加热回流法取干燥粉碎过六号筛的丹参粉末50G，精密称定，置圆底烧瓶中，加热回流提取三次（电热套加热，温度设定为65）每次精密加入400ML75乙醇，浸泡20MIN，提取时间分别为45MIN、40MIN、40MIN，静置10RNIN，过滤，浓缩，即得浸膏，精密称定。同法制备三批样品。1112超声波取干燥粉碎过六号筛的丹参粉末50G，精密称定，置具塞锥形瓶中，利用超声波清洗机超声波共提三次每次精密加入75乙醇400ML，浸泡20MIN，7提取时间分别为30MIN、25MIN、20MIN，静置10MIN，过滤，浓缩，即得浸膏，精密称定。同法制备三批样品。1113组织破碎法取丹参药材50G，采用75乙醇组织破碎法进行提取，使用7倍量、6倍量、6倍量溶剂提取3MIN、2MIN、2MIN，每次提取前浸泡20MIN，提取后静置10MIN，过滤，合并三次滤液，浓缩即得浸膏。同法制备三批样品。表11不同提取方法提取丹参酮的研究超声法加热回流法破碎提取法醇浓度（）757575温度（）256525130453225402时间（MIN）32040214004003502400400300溶剂量（ML）3400400300得膏率（）丹参酮IIA含量（）112色谱条件的确定查阅文献得到的HPLC色谱条件作为参考，在此基础上进行调整，以确定色谱条件。YMCC18色谱柱（250MM46MM，5M）；流速10ML/MIN；柱温25；进样量20L。流动相甲醇（C）05甲酸水溶液（D）梯度洗脱，洗脱程序见表11。检测波长丹参酮IIA为270NM。8表12HPLC洗脱程序洗脱时间C泵（）D泵（）030MIN35633050MIN80201121供试品溶液配制取浸膏50MG，置于50ML棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度。1122对照品溶液的配制精密称取标准品丹参酮IIA5MG，置25ML棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为丹参酮IIA对照品溶液。113系统适用性检查1131线性关系精密量取丹参酮IIA对照品溶液05，10，20，40和80ML于50ML棕色量瓶中，加乙睛至刻度，摇匀。依次吸取丹参酮IIA系列对照品溶液20L，注入液相色谱仪，测定，以丹参酮IIA的峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，计算回归方程并考察线性关系。1132精密度试验取供试品溶液重复测6次，测得丹参酮IIA含量并计算RSD，RSD应小于2。1133重现性试验同一批样品平行测定5份，测得丹参酮IIA的平均含量，并计算RSD，应小于92。1134稳定性试验将同一批待测样品液每隔2H测定一次，测定6次（即共12H），计算RSD，应小于2。1135回收率试验精密称取丹参供试品25MG，置入50ML棕色容量瓶中，其中加入浓度为02MG/ML的丹参酮IIA对照品溶液1ML，得到供试品溶液，进色谱分析。具体如下表表13丹参酮IIA的回收率测定NO称样量（MG）样品中丹参酮IIA的含量（MG）加入丹参酮IIA对照品的含量（MG）丹参酮IIA实测含量（MG）回收率（）平均回收率（）RSD（）102202302402502RSD应小于2。12提取工艺的研究在预实验中确定一种提取方式，再对其进行优化。考虑以下几个方面121提取溶剂的选择10丹参酮属于脂溶性成分，根据相似相溶原理，溶剂极性的选择应适中，极性太小，不能把有效成分提取完全；极性太大，其它成分也会被提取出来；且应考虑环境污染和成本问题，可选择低毒价廉的石油醚、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂为提取溶剂，其中乙醇用的最多，本实验考察50、70、95三个浓度的乙醇。122料液比的选择溶剂体积的选择，应兼顾丹参酮得率和生产成本两个方面。当料液比一定时，丹参酮得率达到较高值，再提高溶剂用量，丹参酮得率增加缓慢，当溶剂用量增大时，溶剂的消耗也增多，增加了生产成本，并且，溶出其他成分的量也增多，给分离带来了困难，可选择的料液比为14、16、18。123提取时间的选择随着提取时间的延长，丹参酮的得率逐渐增大，当达到一定的时间，丹参酮的得率增加不明显，且考虑到能耗，应以此时间为提取时间。可选择的提取时间为20MIN、30MIN、40MIN。124提取次数的选择同样，提取增加，丹参酮的得率也提高，达到一定的提取次数，丹参酮的得率就增加较为缓慢，因此，为了缩短提取时间，提高生产效率，提取次数应适宜。可选择的提取次数为3次、4次、5次。表14丹参酮提取正交实验表因素水平提取溶剂料液比提取时间（MIN）提取次数150乙醇14203270乙醇1630411395乙醇1840513分离工艺的研究目前，丹参酮的富集纯化多用柱层析方法，选择硅胶作为柱填料。131薄板的制备取薄层层析硅胶若干克于研钵中，照硅胶7CMCNA水溶液12，加入CMCNA水溶液调匀、研磨，顺着一个方向搅拌，调成糊状物铺层，水平放置，待自然干燥硅胶颜色渐变色时，移烘箱中110烘30MIN活化，放干燥器中备用。132洗脱剂的选择分别精密称取丹参总酮、丹参酮IIA对照品、丹参酮I对照品、隐丹参酮对照品适量，用甲醇溶解，摇匀避光备用。选取三种不同的展开体系苯石油醚、石油醚丙酮、石油醚乙酸乙酯，根据比移值RF的范围（应在0306之间）和总酮中各成分的分离情况，观察分离效果。133装柱在层析柱出口塞入小量棉花，固定在铁架台上，保持垂直状态，将柱的上端与漏斗连接，注入适量柱层析硅胶，轻轻敲打并在桌上撞实，如此反复，直至填好为止，为使装填紧密，装实后，与真空泵连接除气，装好备用。134样品的处理及上样样品用低沸点的溶剂溶解，然后加入适量的硅胶拌匀，炒干。再均匀置于柱顶尽量使样品带平整。样品在柱子上的载量取决于柱体积、填料类型和分离的需要，本实验以丹参酮IIA的得率为指标，分别按上样量硅胶量为130、11240、150、160进行实验，确定了最佳比例。135洗脱及收集样品上样后将选择好的洗脱剂缓缓加入柱内，保持流速12D/S，在洗脱过程中，会出现不同色段，收集不同色段，与丹参酮IIA对照品相对照，通过薄层检识，合并相同流分，浓缩干燥后，HPLC测定相对含量。13第二章固体脂质纳米粒制备研究21固体脂质纳米粒的制备方法211高剪切乳匀和超声分散高剪切乳匀和超声分散是药剂学中广为应用的一种分散技术，可用来制备乳剂、脂质体等，也可以用于固体脂质纳米粒（SLN）分散体系的制备。它们的优点是操作简单，易于控制。缺点是体系中易出现微米级粒子，如果超声时间大于15MIN，则可能导致金属的污染。212高压乳匀法高压乳匀是目前制备SLN的经典方法。其工作原理是利用高压（10200MPA）推动液体通过一个狭窄的管道（几个微米），液体通过很短的距离而获得了很大的速度（超过1000KM/H），产生的高剪切力和空穴作用力使粒子分裂成纳米级的小粒子。此法的优点是可避免使用对人体有害的附加剂和有机溶剂，尤其适用于对热不稳定的药物。所制得的纳米粒粒径小且分布范围窄，高压乳匀还便于进行大规模生产。乳匀有两种基本的方法热乳匀和冷乳匀，这两种方法都可以制备SLN，但乳匀之前都需将药物溶解或分散在熔化的脂质中，即初步乳化。一般初步乳化如能得到几个微米级的粒子则更有利于乳匀。2121热乳匀热乳匀是指在脂质熔点以上的温度进行操作，将脂质和磷脂等加热至高于脂质的熔点1015左右融化，加入药物，熔融液分散于含有表面活性剂的水相中，初乳化后，通过高压乳匀机循环乳化即得。由于温度升高降低了脂相的粘度，所以原则上讲温度越高得到的产品的粒径就越小。但是并不是温度越高就越好，因为在高温下药物和载体的降解速度也会加快。并且虽然乳匀的步骤可以重复几次，但每次乳匀都会导致体系温度的升高，平均压力每升高50MPA，14可使体系的温度增加100。一般在50150MPA压力下重复35次己足够，如果循环次数增多和压力增大反而会使SLN的粒径增大，因为随着体系温度的升高，粒子聚集倾向加大。通过热乳匀最初得到的仅是一种乳液，脂质还处于一种液体状态，必须使其温度降至写班温或熔点以下，才能形成SLN。由于粒径小和乳化剂的存在，它会在一定的时问内保持一种过冷熔化状态。2122冷乳匀冷乳匀法的制备过程同热乳匀法一样，也需使药物溶解或分散在熔融的脂质中，熔化的样品立即在干冰或液氮中冷却。冷却速度越快，药物在脂质基质中的分布越均匀。再把已凝固的载有药物的脂质碾磨成微米级粒子。由于低温凝固，脂质脆性增加，更易被粉碎，通过球磨或碾钵得到的粒子粒径一般在50100M。然后将它们和含表面活性剂的冷冻溶液在低于脂质熔点510以下高压匀质。此法适用于对热不稳定的药物和熔点低的脂质，还可以避免热乳匀过程中药物向水相流失以及结晶过程中出现的晶型转变和过冷态。但是该法所制得的SLN粒径较大且粒径分布范围较宽。213乳化蒸发法SLN的制备也可以采用PNP的制备方法，但它的一个明显不足是使用了有机溶剂。将脂质和药物首先溶解于有机溶剂中，然后对有机相和含有表面活性剂的水相进行乳化，将有机溶剂蒸发后，即形成SLN。采用该法所得到的SLN粒径很小，甚至可达到25NM。214微乳法微乳是由油相、乳化剂和辅助乳化剂及水所组成的澄清或带有微弱蓝色乳光的热力学稳定的分散体系。现在人们认为微乳并不是一种由微小液滴形成的真正的乳液，而是一种临界溶液（CRITICALSOLUTION）。微乳一方面具有乳液的一15些性质（如可以用激光光散射法测量它的粒径），另一方面它又具有真溶液的一些性质（如药物在微乳中有一定的饱和浓度，而不是像乳剂那样具有一定的油/水分配比例）。将微乳加入到水中会导致油相的沉降从而形成极细的颗粒。微乳的制备方法是用低熔点的脂肪酸（如硬脂酸）、乳化剂、辅助乳化剂和水在6570搅拌制成透明混合液。再在搅拌下向热微乳中加入冷水（23），一般微乳和水的比率为125到150，其稀释程度取决于微乳的组成。为了使微乳中的油相在室温下是固体，需要在制备时使体系的温度高于脂质的熔点。这样SLN颗粒的大小主要受微乳小粒子沉淀影响，而与搅拌速度关系不大。在微乳中液滴己达到纳米级，所以并不需要额外能量。对于微乳来说，不但配方组成，而且温度下降速度与PH值都能影响制剂的质量。降温速度快可以促使脂质快速结晶并避免纳米粒聚集。22固体脂质纳米粒的干燥方法尽管有文献报道SLN的水溶液分散体的粒径能稳定1236个月，但由于SLN分散体是热力学不稳定体系，通常在短时间里就出现粒径的增大、粒子聚合甚至胶凝的现象。为了提高SLN的化学和物理稳定性，保持其原有的粒径，阻止OSTWALD熟化和避免水解，常用的方法是将SLN分散液干燥成固体。另外SLN分散液干燥后，可将药物制成固体制剂如片剂、胶囊等，可以增加药物的给药方式和给药途径。由于SLN的特殊性质，常用的干燥法有冷冻干燥和喷雾干燥。221冷冻干燥法样品经冷冻干燥变成固态后，具有更好的化学和物理稳定性。但是在冻干过程中有两种相变会影响其稳定性。第一，在冷冻干燥过程中从水性分散体变成粉末时，由于样品的渗透压和PH值的改变，可能会引起不稳定问题第二，再增溶作用，粒子由于处在一个低含水量、高粒子浓度、高渗透压的环境中，易发生聚合。冷冻干燥法将降低表面活性剂的保护作用。己经发现，当SLN分散体的脂质含量不超过5时，脂质粒子的直接接触减少，有更高的升华速度和更16高的比表面积，可以有效抑制粒子的聚合。冷冻防护剂的加入可以减少粒子的聚合，还能使得到的干燥产品具有更好的再分散特性。常用的冷冻防护剂有山梨醇、甘露糖、海藻糖、葡萄糖和聚乙烯吡咯烷酮等。冷冻防护剂可以占据离散的脂质纳米粒之间的空间位置，从而阻止其相互接触，还能和表面活性剂的活性位点发生作用，形成一层假性水化壳。一般来讲，冷冻防护剂的浓度在1015之间，SLN的平均粒径和粒径分布在冷冻干燥再分散试验后，平均粒径一般增大1524倍，没有冷冻防护剂的样品的粒径增大得更多。冷冻防护剂的保护作用由大到小为海藻糖蔗糖葡萄糖和麦芽糖。以海藻糖的效果最好，它可以充分阻止粒子的聚合和药物的渗漏。冷冻防护剂加入的时间也会影响最后产品的性质。冷冻防护剂在乳匀之前加入效果最好，平均粒径在冻干过程中几乎不发生改变。冷冻防护剂和脂质的重量比为2639较合适。载药的SLN通过冷冻干燥有可能使其稳定性大大降低，这可能与游离的药物分子有关。载药纳米粒ZETA电位降低，渗透压和PH值改变进而导致粒子的稳定性下降。因此提高药物的包封率尤为重要。冷冻的过程会影响晶体的给构和冻干粉的性质。冷冻的速度取决于特定的样品和条件。快速冷冻会学致小型和异质晶体出现，增加了非晶型的含量，降低冷冻效果。晶体的大小是影响冷冻干燥过程中升华速度的关键因素。大量小晶体和非晶区的出现导致形成非常紧密的冻干粉网，因而降低了升华速度。缓慢冷却可以形成大晶体和自由的升华物，但是常常会增强冷冻所导致的不稳定现象。此外，对冷冻的SLN分散体进行预处理（22处理2H，接着降至40处理2H）可能会提高冻干粉的质量。222喷雾干燥喷雾干燥比冷冻干燥法经济，但较少用于SLN体系。主要是由于高温、高剪切力和脂质的部分熔化，易造成粒子的团聚。只有当脂质熔点大于70，冷冻防护剂和脂质都能在喷雾干燥过程中保持SLN粒径大小不变时才考虑采用此法。23空白固体脂质纳米粒制备方法的筛选17从制得的空白固体脂质纳米粒外观、粒径等对以下方法进行筛选。231溶剂乳化法称取一定量的硬脂酸和卵磷脂溶于10ML三氯甲烷中形成有机相，另称取分子量为5000的PEG修饰物MYRJ59溶于25ML水中形成水相。用6针头注入2000R/MIN搅拌的（752）的水相中，边注入边搅拌，待有机溶剂挥干后，即得固体脂质纳米粒分散液。232熔化匀化法取一定量的硬脂酸加热到（752）熔融，另称取MYRJ59和卵磷脂溶于水中，搅拌使其充分溶解，加热到（752），然后倒入75熔化的硬脂酸中，快速搅拌，逐渐降到室温，即得固体脂质纳米粒分散液。233熔化超声分散法取适量的硬脂酸和卵磷脂放入自制的加热套中加热至（752）熔融保温，另称取MYRJ59溶于水中，搅拌使充分溶解，并加热到（752），倒入熔融保温的加热套中，然后进行超声。经过适当超声后，逐渐降到室温，即得固体脂质纳米粒分散液。234薄膜超声分散法称取卵磷脂和硬脂酸，溶于20ML氯仿中得类脂溶液。将该类脂溶液倒入梨形烧瓶中，置于70恒温水浴中，用旋转蒸发仪在减压的条件下蒸除有机溶剂，使磷脂等成膜材料在烧瓶壁形成一层薄的脂质膜向瓶中加入50ML含MYRJ59的蒸馏水，继续旋转蒸发，直至形成均匀的脂质体悬混液。再将该脂质体悬混液超声分散，即得SLN分散液。235乳化蒸发低温固化法18取处方量的硬脂酸和5ML丙酮加入25ML具塞梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入处方量的卵磷脂氯仿液，微热使溶，构成有机相。另取处方量的MYRJ59溶于30ML高纯水中，构成水相。将有机相以6针头注入1000R/MIN搅拌的（752）的水相，继续搅拌约4H，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ML，将所得的半透明体系快速混于另一02的1000R/MIN搅拌的10ML的水相，继续搅拌2H，即得硬脂酸纳米粒的胶体悬混液。24冰片修饰的丹参酮IIA固体脂质纳米粒的制备通过文献比较，初步推测利用乳化蒸发低温固化方法制备较好。对冰片含量、表面活性剂、卵磷脂、MYRJ59的量采用正交设计法进行优化。丹参酮IIA固体脂质纳米粒的制各方法如下取10MG丹参酮IIA、处方量的冰片和硬脂酸、5ML的丙酮加入25ML具塞梨形瓶中，超声使其充分溶解，加入处方量的卵磷脂氯仿液，微热使溶，构成有机相。另取处方量的MYRJ59溶于高纯水30ML中，构成水相。将有机相以6针头注入1000R/MIN搅拌的（752）的水相，继续搅拌约4H，使有机溶媒完全蒸发并使体系浓缩至约5ML，将所得的半透明体系快速混于另一02的1000R/MIN搅拌的10ML的水相，继续搅拌2H，即得硬脂酸纳米粒的胶体悬混液，体系定容至20ML。表21冰片修饰的丹参酮IIA固体脂质纳米粒制备正交实验表因素水平冰片（G）硬脂酸（MG）卵磷脂（G）MYRJ591018002140202100032003031200432019第三章固体脂质纳米粒的质量评价31外观及稳定性观察取上述制备的冰片修饰的丹参酮IIA固体脂质纳米粒悬混液样本10份，其中5份放置于室温，另外5份放置于4冰箱内。观察24H、1个月、3个月、6个月时其外观的变化，观察5000R/MIN离心10MIN悬混液是否分层或出现沉淀。32形态以及粒径分布取上述制备的固体脂质纳米粒悬混液适量加高纯水稀释，用激光粒度仪测定纳米粒悬混液的粒径分布。取固体脂质纳米粒悬混液适量加高纯水稀释至一定倍数，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2的磷钨酸钠液负染，在透射电镜下观察其粒径大小和形态。33包封率的测定以SEPHADEXG50葡聚糖凝胶柱色谱方法分离固体脂质纳米粒和游离药物，测定其包封率。吸取上述制得的固体脂质纳米粒05ML上柱，以蒸馏水为洗脱介质进行洗脱，根据最佳分离条件，收集含有冰片修饰的IIA丹参酮固体脂质纳米粒的洗脱液，吸取一定量洗脱液加入无水乙醇溶解。再吸取冰片修饰的IIA丹参酮固体脂质纳米粒混悬液05ML，加入无水乙醇溶解，HPLC法分别测定两样品中丹参酮IIA的含量，根据下式求其包封率10/总包WE其中，W包表示被包封的药物量，W总表示冰片修饰的IIA丹参酮固体脂质纳米粒混悬液中的总药量。34物相分析分别取硬脂酸、MYRJ59、丹参酮IIA、冰片及其物理混合物和固体脂质纳米20粒冻干品样品，采用差式扫描热量计分析，以空铝坩为参比，另一铝坩放入样品约5MG，升温速率10/MIN，扫描范围为25400，通入50ML/MIN的N2保护。35体外释药实验精密称取5ML上述制备好的固体脂质纳米粒，放入处理过的透析袋中，透析袋两端夹紧至不渗漏；精密量取PH74磷酸盐缓冲释放液50ML，放入100ML烧杯中将装药透析袋移入装有溶出介质的烧杯中，保持漏槽状态，密封杯口将烧杯置于恒温震荡器内，设置温度为（371），水平震荡频率为150次/MIN。于2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36H取样，分别将烧杯内的溶出介质全部取出，再加入50ML新的同种介质继续恒温震荡。将取出的溶出介质溶液用HPLC法测定丹参酮IIA的浓度，计算药物的释放率，以累积释放率和时间的关系做出体外释药曲线。36体内实验昆明种小白鼠40只，雌雄兼用，2025G，随机分为8组，给药前禁食12H，以20MG/KG的剂量（根据载药量折算成固体脂质纳米粒的量后给药）尾静脉注射，分别在给药后008,025,05,10,15,20,30,40H眼眶采血，同时在025,10,15,20,40H采集脑、心、肝、脾、肺、肾。血液置于预先肝素化的试管中，离心后移取血浆至塑料试管；组织用生理盐水冲净表面血液及内容物后，和血浆于20保存至分析测定。精密量取01ML的血浆于具塞5ML小塑料管中，加入甲醇01ML，涡旋混合1MIN，10000R/MIN离心10MIN，吸取上清液50L进样。将组织称重，按照13的质量浓度比例用甲醇匀浆，离心后移取上清至塑料试管中，按血浆样品的处理方法处理后进样。体内实验可评价该给药系统的靶向性以及能否提高生物利用度。2122第四章口服冰片修饰的丹参酮IIA固体脂质纳米粒剂型研究41固体脂质纳米粒的给药方式411注射给药固体脂质纳米粒最初是为静脉注射的靶向控释药物而设计。脂质液滴（纳米乳）转变成为固体（SLN）以后，药物的扩散系数减小，从而减慢了药物的释放。粒径的分布对于静脉注射用药来说是一个关键问题，它可以导致毛细血管堵塞。造成脂肪栓塞等致死性的严重问题，最细毛细血管的管径为9个微米。从安全的角度考虑，粒径必须全部在亚微米级范围内。人体可以耐受一定数量的微米级的大液滴。但是这种情况不能适用固体脂质纳米粒，因为固体脂质纳米粒不能变形，一旦粒径超过毛细血管直径，血管栓塞现象必然发生。低粘度的固体脂质纳米粒分散体在注射针头内会发生凝胶化，迅速变成一种高粘度的、含有会对人体造成危险的大粒子的悬混液。固体脂质的不可变形性，以及在注射过程中可能发生凝胶化现象，是固体脂质纳米粒分散体用于静脉注射给药时在临床上遇到的主要问题。所以在制备注射给药的固体脂质纳米粒时必须严格控制粒径及乳化剂和辅助乳化剂的比例，防止胶凝。412口服给药固体脂质纳米粒的日服剂型包括水性的分散体和含固体脂质纳米粒的传统剂型形式，如片剂、丸剂或胶囊剂等。通过优化乳化剂和脂质的种类和剂量，可以得到在胃肠道中稳定的固体脂质纳米粒。一般认为，酸性的、高离子强度的胃液微环境，易导致纳米粒聚合。但是实际上纳米粒的聚合并不是决定因素。许多实验数据表明，即使固体脂质纳米粒在一定程度聚合后，其生物利用度仍然很高。413透皮吸收固体脂质纳米粒局部给药具有很大的开发潜力和市场前景。固体脂质纳米粒被认为是替代脂质体的新一代载药系统。和脂质体相似，固体脂质纳米粒是由生物耐受性良好的材料组成，其最突出的优点在于它具有固态基质，这样可以保护化学性质不稳定的物质不被分解破坏，并可以调节药物的释放。固体脂23质纳米粒的粒径很小，具有一定的生物粘附性，比较容易粘附到皮肤上形成薄膜，它可以修复皮肤表面破损的脂质层，并且具有一定的屏蔽作用。载药量低和低粘度对于透皮制剂来说都是不利的。在大多数情况下，固体脂质纳米粒分散体被制备成软膏或凝胶等剂型，确保使用的方便，而这个制备过程使固体脂质纳米粒的浓度进一步减小。固体脂质纳米粒分散体的固体脂质含量升高后，会变成一种半固体，凝胶样的性状，它可以直接涂抹在皮肤上，不需要做进一步的处理。一般来讲，脂质含量的增加会导致粒径的增大。但是鲸蜡醇十六酸酯制成的固体脂质纳米粒在脂质含量高达3040时，竟然保持了胶态粒子的大小，且系统的可塑性也有很大增加。这种体系的流变学特性和传统的皮肤用药相似。以上结果表明，可以一步生产出脂质含量高、粒径小的透皮用固体脂质纳米粒体系。可稀释制备成膏剂，不须制备成凝胶剂。固体脂质纳米粒的一个明显优点是组成成分都是生物相容性原料，避免了对皮肤的刺激和毒性。还可以调节药物在皮肤中的释放，从而提高药物在特定皮肤层中的分配。固体脂质纳米粒在皮肤上涂布后，随着水分的损失和脂质的变形，固体脂质纳米粒的结构将发生改变。电子显微镜表明固体脂质纳米粒分散体在32干燥后变成一层致密的膜，这和前面提到的球形结构不同。这种致密膜的形成可以促进皮肤的闭合作用，提高药物对皮肤的穿透率。414肺部给药迄今为止，脂质纳米粒的肺部给药研究报道不多。为了证明脂质纳米粒肺部给药的可行性，有人将脂质纳米粒悬混液雾化后，再收集雾化后的颗粒并分析其中纳米粒的粒径分布。结果表明雾化前和雾化后纳米粒的粒径分布几乎相同，仅有轻微的粒子聚集现象发生，这对肺部给药没有影响。另外，脂质纳米粒粉末可以制成干粉吸入剂，在喷雾干燥过程中，可以使用乳糖作为保护剂。脂质纳米粒的优点在于它可以控制药物在肺部的释放，延长药物在肺部的释放时间。与聚合物纳米粒相比，脂质纳米粒的降解速度较快。另外，脂质纳24米粒的体内耐受性很好，适于装载对肺巨噬细胞靶向的药物。肺部的粒子易于被巨噬细胞吞噬，因此可以用脂质纳米粒来治疗RES系统的感染。42固体脂质纳米粒冻干粉的制备421处方设计按表41将支架剂加入已制备好的固体脂质纳米粒胶体溶液中，振摇使溶，按常规冷冻干燥方法置低温冷柜中预冻，然后在冷冻干燥机中冻干，得到各处方的冻干产品。表41固体脂质纳米粒支架剂的考察支架剂（）NO葡萄糖乳糖甘露糖外观色泽再分散性评价1100240038004010504060807001800490081044411044124041344014000422评价指标外观以饱满，不塌陷，不皱缩，表面光洁为佳。色泽均匀，无花斑，质地细腻为佳。25再分散性取各处方冻干产品适量，加蒸馏水2ML，振摇后能在30S内完全溶解得均匀淡黄色胶体溶液为佳。评分标准见表42，同一得分以辅料用量少者为佳。表42冻干粉的评价分值外观色泽再分散性02萎缩分层，上下色差明显90S35萎缩分层，上下色差明显6090S68萎缩上下色差明显3060S910饱满均匀，无色差30S43胶囊剂成型采用有机玻璃制成的胶囊板填充。板分上下两层，上层有数百孔洞。先将囊帽、囊身分开，囊身插入胶囊板孔洞中，调节上下层距离，使胶囊口与板面相平。将冻干粉铺于板面，轻轻振动胶囊板，使填充均匀。填满每个胶囊后，将板面多余粉末扫除，顶起囊身，套合囊帽，取出胶囊，即得。26第五章展望心血管疾病、心血管病一直以来都给人类严峻的挑战。随着医学的进步心血管疾病的病死率正在不断降低，但由于患病率的不断上升，它仍然是最常见的死亡原因。作为补充和替代药物，中药有几千年的历史，并取得了巨大的贡献。许多中药的改善血液循环功能已得到广泛认可，作为其中代表的丹参酮的研究在最近几年取得了显著的成果。丹参酮的多种药理作用，包括血管舒张、抗血栓形成、抗发炎、抗氧剂、抗心律失常、抗纤维化等表明丹参酮是一个有前途的心脏保护剂。心脑血管疾病是一种需要长期服药的疾病，而丹参酮在体内的生物利用度低，半衰期短，病人的顺应性差，因此开发丹参酮的缓释制剂势在必行。固体脂质纳米粒是新一代亚微粒给药系统，是极具发展和应用前景的新型药物载体，因其独特的优点和广泛的应用范围，在新药开发领域中举足轻重。将丹参酮制成固体脂质纳米粒能提高其生物利用度，持续释放药物使用药次数减少。另外，固体脂质纳米粒也是在脑靶向方面也有一定的作用，搭配冰片，能更好的使药物穿过血脑屏障，有利于脑出血等疾病的治疗。复方丹参滴丸作为国内目前第一例通过美国FDAII期临床的中成药，通过了全球最为严格的临床试验证明了其安全性和有效性，为将来进军全球市场迈出了坚实的一步，对我国中药现代化和国际化的战略意义十分重大。丹参新剂型的开发也能更好地推动中药走向国际市场，促进中药的现代化和国际化。27参考文献1王力娜HMGB1、RAGE及TLR4在脑梗死大鼠脑组织的动态表达及丹参酮IIA的神经保护作用C河北医科大学,20102陈坚丹参酮抗肿瘤的研究进展J复旦学报,2003,3066266283王昕丹参酮药理研究及临床应用进展J光明中医,2011,267151415174何文凤,吕湛,张全波丹参酮在心血管保护中的药理作用机制研究进展J中国医药导报,2013,102934385